Molecular and biochemical characterization of a rare glucokinase with a cryptic function in environmental mycobacteria

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Daniela Cristina Nunes
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/32158
Resumo: Dissertação de Mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
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spelling Molecular and biochemical characterization of a rare glucokinase with a cryptic function in environmental mycobacteriaMicobactérias ambientaisActinomicetosMycobacteriumSmegmatisIsoenzimasGlucocinaseDissertação de Mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.As micobactérias são um género diverso de actinobactérias cujos membros mais conhecidos são também os mais ameaçadores, Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae. O modo de vida destes parasitas obrigatórios não é no entanto representativo do género, uma vez que na sua maioria as espécies de micobactérias são ambientais e saprófitas, fazendo parte das comunidades microbianas do solo e da água. Estas espécies ambientais são também capazes de causar infecções oportunistas que colocam importantes desafios terapêuticos pelo aumento generalizado de casos, o que tem estimulado um renovado interesse no estudo da sua ecologia e fisiologia únicas. Um desenvolvimento recente no âmbito da glicobiologia micobacteriana foi a descoberta de uma via essencial de síntese de α-glucanos em que trealose é convertida em maltose e subsequentemente fosforilada a maltose 1-fosfato, que é adicionada a cadeias crescentes de glucanos por uma maltosiltransferase. Em micobactérias, os genes que codificam as duas primeiras enzimas nesta via, trealose sintase (TreS) e maltocinase (Mak), surgem associados reflectindo a sua ligação metabólica. Um segundo gene anotado como maltocinase foi identificado no genoma de apenas algumas micobactérias ambientais e alguns outros actinomicetos, estando incluído num cluster de genes raro mas conservado e sem associação com TreS. O modelo experimental Mycobacterium smegmatis foi seleccionado para investigar este homólogo da Mak. Clonámos o gene e purificámos a proteína recombinante, que verificámos fosforilar glucose a glucose 6-fosfato a 37°C e pH 8 (condições óptimas) requerendo a presença de iões Mg2+. Tal como outras cinases, esta glucocinase (GluK) apresenta uma actividade residual de ATPase que é no entanto exacerbada na presença de Zn2+ ou Mn2+. A enzima segue uma cinética de Michaelis-Menten tanto para a actividade de glucocinase como para a de ATPase. A função fisiológica desta GluK permanece obscura mas a caracterização molecular e bioquímica descritas neste trabalho contribuem para elucidar o seu papel e possível participação numa nova via metabólica em micobactérias ambientais.Mycobacteria are a diverse genus of actinobacteria better known for its most threatening members Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae. However, the lifestyle of these strict pathogens is not representative of the genus since the majority of mycobacterial species are saprophytic environmental microorganisms and part of water and soil microbial communities. They are also opportunistic pathogens that pose novel and challenging therapeutic obstacles highlighted by the steady increase in infections for which they are responsible, which has been met with a renewed interest in studying their unique ecological and physiological traits. A recent development in mycobacterial glycobiology was the discovery of a novel and essential pathway of α-glucan synthesis whereby trehalose is converted to maltose itself phosphorylated to maltose 1-phosphate, which is then added to growing glucan chains by a maltosyltransferase. The genes coding for the two first enzymes in this pathway, trehalose synthase (TreS) and maltokinase (Mak), are almost always associated in the same gene cluster reflecting their metabolic connection. We identified a second gene annotated as a maltokinase in the genome of only a few strains of environmental mycobacteria and a few other actinomycetes, included in a different genomic context within a rare but conserved gene cluster. The widelystudied model organism Mycobacterium smegmatis was selected to investigate this Mak homologue. We cloned the gene and purified the recombinant enzyme, which we found to specifically phosphorylate glucose to glucose 6-phosphate at 37°C and pH 8 (optimal conditions) with a strict requirement for Mg2+. Similarly to other kinases, this glucokinase (GluK) displayed a residual ATPase activity which was unexpectedly and strongly stimulated in the presence of Zn2+ or Mn2+. The enzyme exhibited Michaelis- Menten kinetics for both glucokinase and ATPase activities. GluK’s physiological function remains elusive but the molecular and biochemical characterization reported here represents an important first step in elucidating its role and possible participation in a novel pathway in environmental mycobacteria.2015info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/32158http://hdl.handle.net/10316/32158TID:201671735engCOSTA, Daniela Cristina Nunes - Molecular and biochemical characterization of a rare glucokinase with a cryptic function in environmental mycobacteria. Coimbra : [s.n.], 2015. 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