Expressão em Escherichia coli da proteína capsidial do Watermelon mosaic virus e produção de anti-soro

• Autor(a) principal: Barbieri,Manuela R.
• Data de Publicação: 2004
• Outros Autores: Carvalho,Murilo G. de, Zambolim,Eunize M., Zerbini,F. Murilo
• Tipo de documento: Artigo
• Idioma: por
• Título da fonte: Fitopatologia Brasileira
• Texto Completo: http://old.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-41582004000200017
• topic: Cucurbitáceas; ELISA; imunodifusão; Western blot

Um anti-soro policlonal específico para Watermelon mosaic virus (WMV) foi produzido por meio da imunização de coelhos com proteína capsidial purificada, expressa in vitro em células de Escherichia coli. O gene cp foi amplificado via RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos, a partir de RNA viral extraído de preparações virais concentradas. O fragmento amplificado foi clonado em pBLUESCRIPT KS+ e completamente seqüenciado para confirmação de sua identidade e integridade. Em seguida, o fragmento foi subclonado no vetor de expressão pRSET-A. Plasmídeos recombinantes foram utilizados para a expressão da proteína capsidial em E. coli BL21::DE3. A proteína foi purificada por meio de cromatografia de afinidade em coluna de Ni+-NTA, a partir de proteínas totais extraídas de E. coli. Uma vez purificada, a proteína foi quantificada e utilizada para imunização dos coelhos. O anti-soro foi testado quanto a sua especificidade e sensibilidade em testes de Western blot, DAS-ELISA, imunodifusão e ELISA indireto. Todos os testes demonstraram que o anti-soro produzido a partir da expressão in vitro da proteína capsidial é altamente específico para a detecção do WMV em extratos foliares, não tendo sido observada nenhuma reação heteróloga interespecífica.