Detecção, isolamento in vitro e caracterização molecular de murino norovirus para modelo de estudo de norovirus humano

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Oliveira, Diane Sthefany Lima de
Data de Publicação: 2013
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UCB
Texto Completo: https://repositorio.ucb.br:9443/jspui/handle/10869/2746
Resumo: Biomedicina
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Devido à semelhança molecular entre o vírus humano e o murino, a padronização da detecção e do isolamento de murino norovírus (MNV) torna-se necessária para que modelos experimentais de norovírus humano sejam criados com o objetivo de gerar mecanismos de prevenção, controle e tratamento das noroviroses. Foram coletadas 22 amostras fecais de camundongos provenientes de um biotério de Brasília e outras 5 amostras positivas anteriormente para presença de MNV foram cedidas. Para triagem de MNV foi realizada RT-PCR em todas as amostras suspendidas a 20% em PBS. Em placas com células RAW 264.7 foram inoculados 150 μL de suspensões fecais, diluídas em série, para avaliação de efeito citopático, sendo realizadas de cada amostra três passagens em cultura celular. A RT-PCR dos produtos de cultura viral de cada passagem foi realizada. Os métodos para clonagem e sequenciamento de cerca de 2,4 kb da extremidade 3’ de MNV de uma amostra fecal foram procedidos. Das 22 suspensões fecais testadas por RT-PCR, 2 foram positivas para MNV. Na cultura celular duas amostras foram positivas por RT-PCR, no entanto, apenas em uma foi observado efeito citopático (PR+Ob), a qual foi submetida à clonagem e sequenciamento de dois fragmentos das extremidades (sense e anti-sense). A análise filogenética dos fragmentos sugere maior proximidade com MNV 2. A percepção de efeito citopático em apenas uma amostra e a detecção da mesma em passagens limitadas sugere perda da integralidade da partícula viral necessária à infecção e subjetividade analítica.There are evidences that annually 2.5 million of children (≤ 5 years) die worldwide and about 200.000 are hospitalized in the United States due to acute gastroenteritis. Now the genus Norovirus of the family Caliciviridae is recognized as the most common viral cause of outbreaks of the disease. However, it has not been possible to isolate the virus in cell culture. Due to molecular similarity between the human and murine viruses, standardization of detection and isolation of Murine norovirus (MNV) is necessary to create Human norovirus experimental models with the goal of generating mechanisms of prevention, control and treatment about the noroviruses. Were collected 22 mice’s fecal samples from a vivarium of Brasilia and other 5 samples positive for the presence of MNV previously were donated. For screening MNV, RT-PCR was performed on all samples suspended at 20 % in PBS. Plates with RAW 264.7 cells were inoculated with 150 μl of serially diluted fecal suspensions to identify the cytopathic effect, and three passages in cell culture were performed for each sample. From the RT-PCR product was performed viral culture of each passage. Cloning and sequencing methods of approximately 2.4 kb of 3' MNV genome were preceded. From 22 fecal suspensions tested by RT-PCR, two were positive to MNV. Two samples were positive in cell culture by RT-PCR, however, only one presented cytopathic effect (Ob + PR), which was cloned and sequenced the ends of two fragments (sense and anti-sense). Phylogenetic analysis of the fragments suggests greater proximity to MNV 2. The perception of CPE in only one sample and its detection in limited passages suggest analytic subjectivity and loss of the viral particle integrity needed to infection.Submitted by Juliana Pereira (juliana.pereira@ucb.br) on 2014-03-14T14:02:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20168 bytes, checksum: 288037d582f66c131a3b54761360a7bc (MD5) TCC II - Diane Sthefany Lima de Oliveira.pdf: 1349143 bytes, checksum: 2cafbcfb3fe8a9446e2c50ec9d68cc16 (MD5)Approved for entry into archive by Kelson Anthony de Menezes(kelson@ucb.br) on 2014-03-21T20:09:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20168 bytes, checksum: 288037d582f66c131a3b54761360a7bc (MD5) TCC II - Diane Sthefany Lima de Oliveira.pdf: 1349143 bytes, checksum: 2cafbcfb3fe8a9446e2c50ec9d68cc16 (MD5)Made available in DSpace on 2014-03-21T20:09:52Z (GMT). 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There are evidences that annually 2.5 million of children (≤ 5 years) die worldwide and about 200.000 are hospitalized in the United States due to acute gastroenteritis. Now the genus Norovirus of the family Caliciviridae is recognized as the most common viral cause of outbreaks of the disease. However, it has not been possible to isolate the virus in cell culture. Due to molecular similarity between the human and murine viruses, standardization of detection and isolation of Murine norovirus (MNV) is necessary to create Human norovirus experimental models with the goal of generating mechanisms of prevention, control and treatment about the noroviruses. Were collected 22 mice’s fecal samples from a vivarium of Brasilia and other 5 samples positive for the presence of MNV previously were donated. For screening MNV, RT-PCR was performed on all samples suspended at 20 % in PBS. Plates with RAW 264.7 cells were inoculated with 150 μl of serially diluted fecal suspensions to identify the cytopathic effect, and three passages in cell culture were performed for each sample. From the RT-PCR product was performed viral culture of each passage. Cloning and sequencing methods of approximately 2.4 kb of 3' MNV genome were preceded. From 22 fecal suspensions tested by RT-PCR, two were positive to MNV. Two samples were positive in cell culture by RT-PCR, however, only one presented cytopathic effect (Ob + PR), which was cloned and sequenced the ends of two fragments (sense and anti-sense). Phylogenetic analysis of the fragments suggests greater proximity to MNV 2. The perception of CPE in only one sample and its detection in limited passages suggest analytic subjectivity and loss of the viral particle integrity needed to infection.
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