Padronização de uma semi-nested PCR em única etapa para a detecção molecular de fungos patogênicos

• Autor(a) principal: Pitz, Amanda de Fáveri
• Data de Publicação: 2024
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UEL
• Texto Completo: https://repositorio.uel.br/handle/123456789/12601
• topic: Patologia experimental; Fungos patogênicos; Diagnóstico molecular; Paracoccidioidomicose; Micoses fungóides; Experimental pathology; Molecular diagnosis; Pathogenic fungi

Resumo: Na tentativa de contribuir para um diagnóstico mais rápido e preciso para infecções fúngicas, uma reação de semi-nested PCR em única etapa foi desenvolvida com oligonucleotídeos iniciadores para a região ITS do DNA ribossomal O limite de detecção desta reação foi de 2,5 pg para DNA dos fungos P brasiliensis e H capsulatum Não foram observadas reações cruzadas com os fungos Candida albicans, Sporothrix schenkii, T rubrum e Cryptococcus sp Para avaliar a eficiência da semi-nested PCR em única etapa desenvolvida neste estudo, fizemos a sua comparação com outras reações baseadas na reação em cadeia da polimerase (nested e semi-nested PCR) para identificação do fungo P brasiliensis, utilizando DNA extraído de cultura e também de amostras de escarro de pacientes portadores da infecção No total foram comparadas quatro reações diferentes, sendo duas de nested-PCR, uma de semi-nested PCR e uma de semi-nested PCR em única etapa (desenvolvida neste estudo), todas utilizam como alvo sequências das regiões espassadoras internas - Internal Transcribed Spacer (ITS1 e ITS2), caracterizada por possuir regiões altamente conservadas e regiões altamente específicas Os resultados nos mostraram que o método de Imai et al (2) é o que apresenta menor limite de detecção (2,5 ng), enquanto que a reação de Theodoro et al (25) tem um limite de até 25 pg, enquanto a reação de Koishi et al (21) apresentou um limite de detecção de 2,5 pg, assim como a semi-nested PCR em única etapa desenvolvida neste estudo A comparação também foi realizada com 14 amostras de escarro, sendo que a semi-nested PCR em única etapa e a reação de Koishi et al (21) foram positivas para todas as amostras, enquanto que as reações de Theodoro et al (25) e Imai et al (2) foram positivas para 8 e 4 amostras respectivamente Foi também observado que a principal causa da diferença dos limites de detecção e do número de amostras clínicas positivas entre as reações foi o número de ciclos, uma vez que com o aumento do número de ciclos foi observado um aumento do limite de detecção e da quantidade de amostras clínicas para ambas as reações A reação de semi-nested PCR em única etapa desenvolvida neste trabalho mostrou um limite de detecção semelhante a outras reações descritas na literatura, porém ela é mais rápida e menos propensa a contaminação do que as reações já descritas Além disso, pode ser modificada para detecção de outros fungos patogênicos pela utilização de oligonucleotídeos iniciadores específicos Por isso, esta reação de semi-nested PCR tem um grande potencial para ser utilizada no âmbito do diagnóstico molecular de infecções fúngicas