Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae
Autor(a) principal: | |
---|---|
Data de Publicação: | 2016 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPG |
Texto Completo: | http://tede2.uepg.br/jspui/handle/prefix/863 |
Resumo: | The bacterial RecA protein plays a role in the complex system of DNA damage repair. In the presence of ATP, RecA proteins polymerize onto single-strand DNA (ssDNA) as righthanded helical nucleoprotein laments, and catalyze strand exchange reaction between the ssDNA and homologous double-strand DNA (dsDNA) molecules. These activities are supported or stimulated by accessory proteins, as the single-stranded binding protein (SSB).Here, we report a functional and structural characterization of the Herbaspirillum seropedicae RecA protein (HsRecA).We report the crystal structure of HsRecA-ADP/ATP complex to 1.7 Å of atomic resolution. HsRecA protein contains a small N-terminal domain, a central core ATPase domain and a large C-terminal domain, similarly to homologous RecA proteins. Comparative structural analysis showed that the N-terminal polymerization motif of archaeal and eukaryotic RecA family proteins are also present in bacterial RecAs. The bacterial polymerization motif contains the sequence SV/IMR/KLG which interacts with the core ATPase domain residues DNLLLV/CS. In the inactive RecA, it is a loop - strand interaction, respectively, while in the active RecA it becomes a dyad strand. In both RecA forms, the polymerization motif seems to stabilize the subunitsubunit interface by hydrophobic interactions. The methionine of this motif may play an important role in the stability and formation of a right-handed helical nucleoprotein lament. The ATPase activity and the structure of the nucleoprotein lament of HsRecA and Escherichia coli RecA (EcRecA) were analyzed in the presence and absence of SSB. When SSB was added after RecA+ssDNA, HsRecA and EcRecA showed similar ATPase activity and nucleolament structure. However, when SSB was either not included or it was added before RecA+ssDNA, the HsRecA showed higher ATPase activity and formed longer nucleoprotein laments than EcRecA. Thus, HsRecA protein is more ecient at displacing SSB from ssDNA than EcRecA protein. HsRecA promoted DNA exchange more eficiently: a greater yield of nicked circular products were obtained in a shorter time. Reconstruction of electrostatic potential from the hexameric structure of HsRecAADP/ ATP revealed a high positive charge along the inner side, which is consistent with the fact that ssDNA binds inside the filament. It may explain the enhance capacity of HsRecA protein to bind ssDNA, forming a contiguous nucleoprotein filament, displace SSB and promote eficiently the DNA strand exchange reaction. Keywords: RecA, Crystallography, RecA nucleoprotein filament, ATPase activity, DNA strand exchange, crystal structure, structural analysis. |
id |
UEPG_89b8b3e3e263446229b894298785b271 |
---|---|
oai_identifier_str |
oai:tede2.uepg.br:prefix/863 |
network_acronym_str |
UEPG |
network_name_str |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPG |
repository_id_str |
|
spelling |
Saab, Sérgio da CostaCPF:40886700191http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727955P9Brinatti, André MaurícioCPF:07970895867http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721194Y3Benelli, ElaineCPF:12376166896http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4795604D5Chubatsu, Leda SatieCPF:11202855857http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797761E7Andrade, André Vitor Chaves deCPF:46652981904http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4779269Z8CPF:04468925990Leite, Wellington Claiton2017-07-21T19:25:54Z2016-11-032017-07-21T19:25:54Z2016-09-06LEITE, Wellington Claiton. Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae. 2016. 131 f. Tese (Doutorado em Fisica) - UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA, Ponta Grossa, 2016.http://tede2.uepg.br/jspui/handle/prefix/863The bacterial RecA protein plays a role in the complex system of DNA damage repair. In the presence of ATP, RecA proteins polymerize onto single-strand DNA (ssDNA) as righthanded helical nucleoprotein laments, and catalyze strand exchange reaction between the ssDNA and homologous double-strand DNA (dsDNA) molecules. These activities are supported or stimulated by accessory proteins, as the single-stranded binding protein (SSB).Here, we report a functional and structural characterization of the Herbaspirillum seropedicae RecA protein (HsRecA).We report the crystal structure of HsRecA-ADP/ATP complex to 1.7 Å of atomic resolution. HsRecA protein contains a small N-terminal domain, a central core ATPase domain and a large C-terminal domain, similarly to homologous RecA proteins. Comparative structural analysis showed that the N-terminal polymerization motif of archaeal and eukaryotic RecA family proteins are also present in bacterial RecAs. The bacterial polymerization motif contains the sequence SV/IMR/KLG which interacts with the core ATPase domain residues DNLLLV/CS. In the inactive RecA, it is a loop - strand interaction, respectively, while in the active RecA it becomes a dyad strand. In both RecA forms, the polymerization motif seems to stabilize the subunitsubunit interface by hydrophobic interactions. The methionine of this motif may play an important role in the stability and formation of a right-handed helical nucleoprotein lament. The ATPase activity and the structure of the nucleoprotein lament of HsRecA and Escherichia coli RecA (EcRecA) were analyzed in the presence and absence of SSB. When SSB was added after RecA+ssDNA, HsRecA and EcRecA showed similar ATPase activity and nucleolament structure. However, when SSB was either not included or it was added before RecA+ssDNA, the HsRecA showed higher ATPase activity and formed longer nucleoprotein laments than EcRecA. Thus, HsRecA protein is more ecient at displacing SSB from ssDNA than EcRecA protein. HsRecA promoted DNA exchange more eficiently: a greater yield of nicked circular products were obtained in a shorter time. Reconstruction of electrostatic potential from the hexameric structure of HsRecAADP/ ATP revealed a high positive charge along the inner side, which is consistent with the fact that ssDNA binds inside the filament. It may explain the enhance capacity of HsRecA protein to bind ssDNA, forming a contiguous nucleoprotein filament, displace SSB and promote eficiently the DNA strand exchange reaction. Keywords: RecA, Crystallography, RecA nucleoprotein filament, ATPase activity, DNA strand exchange, crystal structure, structural analysis.A proteína RecA bacteriana desempenha um importante papel no complexo sistema de reparo de danos ao DNA. Na presença de ATP, a proteína RecA se auto-polimeriza sobre o DNA simples ta (ssDNA) (do inglês single-strand DNA (ssDNA)) como um lamento de nucleoproteína helicoidal, cataliza a reação de troca de fitas entre as moléculas ssDNA e a ta de DNA dupla fita homóloga (dsDNA) (do inglês double-strand DNA (dsDNA)). Estas atividades são suportadas ou estimuladas por proteínas acessórias, como a proteína ligadora de ssDNA SSB (do inglês single-stranded binding protein (SSB)). Neste trabalho é apresentado a caracterização estrutural e funcional da proteína RecA da bactéria Herbaspirillum seropedicae. A estrutura tridimensional do complexo HsRecA-ADP/ATP foi resolvida numa resolução 1,7 Å. A estrutura monomérica da proteína HsRecA consiste em um pequeno domínio N-terminal, um domínio central contendo um sitío ATPásico e e um grande domínio C-terminal, similar com proteínas RecAs homólogas. Análises estruturais comparativas mostraram que o motivo de polimerização da região N-terminal de proteí- nas da familia RecA que incluem archaea e eucariotos, também está presente na proteína RecA bacteriana. O motivo de polimerização da região N-terminal de bactérias contêm a sequência de resíduos (Serina, Valina ou Isoleucina, Metionina, Arginina ou Lisina, Leucina, Glicina) que interage com a sequência de resíduos do core ATPásico (Aspartato, Asparagina, Leucina, Leucina, Leucina, Valina, Cisteína, Serina). Na proteína RecA inativa esta interação é do tipo loop - strand, respectivamente, enquanto na proteína RecA ativa essa interação se torna uma dupla -strand. Em ambas formas da RecA, o motivo de polimerização parece estabilizar a interface subunidade-subunidade por interações hidrofóbicas. No motivo N-terminal a presença de uma Metionina altamente conservada talvez desempenha um importante papel na estabilidade e formação do lamento de nucleoproteína. A atividade ATPásica e a estrutura do lamento de nucleoproteína da proteína HsRecA e da Escherichia coli RecA (EcRecA) foram analisadas na presença e ausência da proteína SSB. Quando a SSB foi adicionada após RecA+ssDNA, as proteínas HsRecA e EcRecA mostraram similar atividade ATPásica e estrutura de nucleo lamento. Entretanto, quando a SSB não estava incluída ou quando adicionada anteriormente a adição RecA+ssDNA, a proteína HsRecA mostrou maior atividade ATPásica e formou maiores lamentos de nucleoproteína que a proteína EcRecA. Ainda, a proteína HsRecA é mais eficiente em deslocar a SSB do ssDNA que a proteína EcRecA. A proteína HsRecA também promove a reação de troca de fitas mais eficientemente: uma maior quantidade de produtos duplex substrato convertido em duplex circular foram obtidos em um curto intervalo de tempo. A reconstrução do potencial eletrostático da estrutura hexamérica da proteína HsRecA revelou uma maior densidade de cargas positivas no seu interior, que é consistente com o fato que o ssDNA ligar-se internamente ao filamento hexamérico. Isto talvez possa explicar capacidade melhorada da proteína HsRecA ligar-se ao ssDNA, formando um continuo filamento de nucleoproteína, deslocando a SSB e ainda promovendo de forma eficiente a reação de trocas de fitas.Made available in DSpace on 2017-07-21T19:25:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wellington Claiton Leite.pdf: 3789073 bytes, checksum: f4c16b4260fbd54f4eada652038ae5bc (MD5) Previous issue date: 2016-09-06Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superiorapplication/pdfporUNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSAPrograma de Pós-Graduação em CiênciasUEPGBRFisicaRecAcristalografiafilamento de nucleoproteína RecAatividade ATP básicareação de troca de fitasestrutura cristalinaanálise estruturalRecAcrystallographyRecA nucleoprotein flamentATPase activityDNA strand exchangecrystal structurestructural analysisCNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::FISICACaracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicaeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPGinstname:Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG)instacron:UEPGORIGINALWellington Claiton Leite.pdfapplication/pdf3789073http://tede2.uepg.br/jspui/bitstream/prefix/863/1/Wellington%20Claiton%20Leite.pdff4c16b4260fbd54f4eada652038ae5bcMD51prefix/8632017-07-21 16:25:54.169oai:tede2.uepg.br:prefix/863Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttps://tede2.uepg.br/jspui/PUBhttp://tede2.uepg.br/oai/requestbicen@uepg.br||mv_fidelis@yahoo.com.bropendoar:2017-07-21T19:25:54Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPG - Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG)false |
dc.title.por.fl_str_mv |
Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae |
title |
Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae |
spellingShingle |
Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae Leite, Wellington Claiton RecA cristalografia filamento de nucleoproteína RecA atividade ATP básica reação de troca de fitas estrutura cristalina análise estrutural RecA crystallography RecA nucleoprotein flament ATPase activity DNA strand exchange crystal structure structural analysis CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::FISICA |
title_short |
Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae |
title_full |
Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae |
title_fullStr |
Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae |
title_full_unstemmed |
Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae |
title_sort |
Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae |
author |
Leite, Wellington Claiton |
author_facet |
Leite, Wellington Claiton |
author_role |
author |
dc.contributor.advisor1.fl_str_mv |
Saab, Sérgio da Costa |
dc.contributor.advisor1ID.fl_str_mv |
CPF:40886700191 |
dc.contributor.advisor1Lattes.fl_str_mv |
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727955P9 |
dc.contributor.referee1.fl_str_mv |
Brinatti, André Maurício |
dc.contributor.referee1ID.fl_str_mv |
CPF:07970895867 |
dc.contributor.referee1Lattes.fl_str_mv |
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721194Y3 |
dc.contributor.referee2.fl_str_mv |
Benelli, Elaine |
dc.contributor.referee2ID.fl_str_mv |
CPF:12376166896 |
dc.contributor.referee2Lattes.fl_str_mv |
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4795604D5 |
dc.contributor.referee3.fl_str_mv |
Chubatsu, Leda Satie |
dc.contributor.referee3ID.fl_str_mv |
CPF:11202855857 |
dc.contributor.referee3Lattes.fl_str_mv |
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797761E7 |
dc.contributor.referee4.fl_str_mv |
Andrade, André Vitor Chaves de |
dc.contributor.referee4ID.fl_str_mv |
CPF:46652981904 |
dc.contributor.referee4Lattes.fl_str_mv |
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4779269Z8 |
dc.contributor.authorID.fl_str_mv |
CPF:04468925990 |
dc.contributor.author.fl_str_mv |
Leite, Wellington Claiton |
contributor_str_mv |
Saab, Sérgio da Costa Brinatti, André Maurício Benelli, Elaine Chubatsu, Leda Satie Andrade, André Vitor Chaves de |
dc.subject.por.fl_str_mv |
RecA cristalografia filamento de nucleoproteína RecA atividade ATP básica reação de troca de fitas estrutura cristalina análise estrutural |
topic |
RecA cristalografia filamento de nucleoproteína RecA atividade ATP básica reação de troca de fitas estrutura cristalina análise estrutural RecA crystallography RecA nucleoprotein flament ATPase activity DNA strand exchange crystal structure structural analysis CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::FISICA |
dc.subject.eng.fl_str_mv |
RecA crystallography RecA nucleoprotein flament ATPase activity DNA strand exchange crystal structure structural analysis |
dc.subject.cnpq.fl_str_mv |
CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::FISICA |
description |
The bacterial RecA protein plays a role in the complex system of DNA damage repair. In the presence of ATP, RecA proteins polymerize onto single-strand DNA (ssDNA) as righthanded helical nucleoprotein laments, and catalyze strand exchange reaction between the ssDNA and homologous double-strand DNA (dsDNA) molecules. These activities are supported or stimulated by accessory proteins, as the single-stranded binding protein (SSB).Here, we report a functional and structural characterization of the Herbaspirillum seropedicae RecA protein (HsRecA).We report the crystal structure of HsRecA-ADP/ATP complex to 1.7 Å of atomic resolution. HsRecA protein contains a small N-terminal domain, a central core ATPase domain and a large C-terminal domain, similarly to homologous RecA proteins. Comparative structural analysis showed that the N-terminal polymerization motif of archaeal and eukaryotic RecA family proteins are also present in bacterial RecAs. The bacterial polymerization motif contains the sequence SV/IMR/KLG which interacts with the core ATPase domain residues DNLLLV/CS. In the inactive RecA, it is a loop - strand interaction, respectively, while in the active RecA it becomes a dyad strand. In both RecA forms, the polymerization motif seems to stabilize the subunitsubunit interface by hydrophobic interactions. The methionine of this motif may play an important role in the stability and formation of a right-handed helical nucleoprotein lament. The ATPase activity and the structure of the nucleoprotein lament of HsRecA and Escherichia coli RecA (EcRecA) were analyzed in the presence and absence of SSB. When SSB was added after RecA+ssDNA, HsRecA and EcRecA showed similar ATPase activity and nucleolament structure. However, when SSB was either not included or it was added before RecA+ssDNA, the HsRecA showed higher ATPase activity and formed longer nucleoprotein laments than EcRecA. Thus, HsRecA protein is more ecient at displacing SSB from ssDNA than EcRecA protein. HsRecA promoted DNA exchange more eficiently: a greater yield of nicked circular products were obtained in a shorter time. Reconstruction of electrostatic potential from the hexameric structure of HsRecAADP/ ATP revealed a high positive charge along the inner side, which is consistent with the fact that ssDNA binds inside the filament. It may explain the enhance capacity of HsRecA protein to bind ssDNA, forming a contiguous nucleoprotein filament, displace SSB and promote eficiently the DNA strand exchange reaction. Keywords: RecA, Crystallography, RecA nucleoprotein filament, ATPase activity, DNA strand exchange, crystal structure, structural analysis. |
publishDate |
2016 |
dc.date.available.fl_str_mv |
2016-11-03 2017-07-21T19:25:54Z |
dc.date.issued.fl_str_mv |
2016-09-06 |
dc.date.accessioned.fl_str_mv |
2017-07-21T19:25:54Z |
dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
format |
doctoralThesis |
status_str |
publishedVersion |
dc.identifier.citation.fl_str_mv |
LEITE, Wellington Claiton. Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae. 2016. 131 f. Tese (Doutorado em Fisica) - UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA, Ponta Grossa, 2016. |
dc.identifier.uri.fl_str_mv |
http://tede2.uepg.br/jspui/handle/prefix/863 |
identifier_str_mv |
LEITE, Wellington Claiton. Caracterização Funcional e Determinação da Estrutura Tridimensional por Cristalografia de Raios X da Proteína RecA de Herbaspirillum seropedicae. 2016. 131 f. Tese (Doutorado em Fisica) - UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA, Ponta Grossa, 2016. |
url |
http://tede2.uepg.br/jspui/handle/prefix/863 |
dc.language.iso.fl_str_mv |
por |
language |
por |
dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
eu_rights_str_mv |
openAccess |
dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
dc.publisher.none.fl_str_mv |
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA |
dc.publisher.program.fl_str_mv |
Programa de Pós-Graduação em Ciências |
dc.publisher.initials.fl_str_mv |
UEPG |
dc.publisher.country.fl_str_mv |
BR |
dc.publisher.department.fl_str_mv |
Fisica |
publisher.none.fl_str_mv |
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA |
dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPG instname:Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG) instacron:UEPG |
instname_str |
Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG) |
instacron_str |
UEPG |
institution |
UEPG |
reponame_str |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPG |
collection |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPG |
bitstream.url.fl_str_mv |
http://tede2.uepg.br/jspui/bitstream/prefix/863/1/Wellington%20Claiton%20Leite.pdf |
bitstream.checksum.fl_str_mv |
f4c16b4260fbd54f4eada652038ae5bc |
bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv |
MD5 |
repository.name.fl_str_mv |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPG - Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG) |
repository.mail.fl_str_mv |
bicen@uepg.br||mv_fidelis@yahoo.com.br |
_version_ |
1809460451374792704 |