Expressão de genes de virulência por Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) sorotipo O157: H7 em diferentes concentrações de disponibilidade de ferro, em multiplicação extracelular e no compartimento intracelular de enterócitos humanos (linhagem Caco-2)

• Autor(a) principal: Gonçalves, Thays Araujo
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UERJ
• Texto Completo: http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/14347
• topic: EHEC O157:H7; Gene transcription; Intracellular multiplication; Caco-2 cells; Iron; EHEC O157:H7; Transcrição gênica; Multiplicação intracelular; Células Caco-2; Ferro; Escherichia coli; Virulência (Microbiologia); Escherichia coli O157; Expressão gênica; Ferro; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA::MICROBIOLOGIA APLICADA::MICROBIOLOGIA MEDICA

E. coli produtoras de toxina Shiga (STEC) colonizam o intestino de ruminantes e são veiculadas por alimentos, como carne crua e leite não pasteurizado. Aquelas associadas a casos severos ou surtos em humanos são conhecidas como EHEC (E.coli enterohemorrágicas) e pertencem a certos sorotipos, particularmente O157:H7. Além de produzirem uma ou mais toxinas Shiga, carreiam uma ilha de patogenicidade denominada LEE e um grande número de genes cromossômicos e plasmidiais envolvidos na sua virulência. Atualmente, admite-se que a patogenicidade de EHEC O157:H7 envolve interações com células fagocíticas profissionais. Neste estudo, investigou-se a transcrição por PCR quantitativo (qPCR) de genes envolvidos na virulência (gadE, fliC, nleD, espJ, pagC, espL2, stx2a, chuA, iha, ler, tir, soxR, lpfA2) em duas cepas de EHEC O157:H7 (EDL 933 [ATCC 43895] e EDL 931 [ATCC 35150]) para as quais verificou-se diferenças marcantes (10 a 20 vezes) na invasão de células enterocíticas humanas da linhagem Caco-2. Inicialmente, verificou-se se ocorriam diferenças entre as cepas na expressão de genes putativos de virulência regulados pela disponibilidade de ferro (chuA,iha, ler, soxR, stx2a e lpfA2), quando cultivadas em meio DMEM sem ferro ou suplementado com o metal. Ambas as cepas apresentaram perfil semelhante quanto a transcrição dos genes de virulência e detectou-se aumento na transcrição do gene iha em função da carência de ferro, sugerindo que em EHEC O157:H7 a adesina Iha deve atuar como um sideróforo, como já descrito para E. coli uropatogênicas. Em seguida, investigou-se a expressão de todos os genes em populações bacterianas recuperadas do compartimento intracelular de células Caco-2 nos tempos de infecção de 2 e 24 horas. Como referência foi utilizado o perfil de expressão gênica dos micro-organismos extracelulares aderidos (2 horas) à superfície celular e impedidos de invadir pela ação de citocalasina D. As duas cepas mostraram diferenças marcantes na expressão de vários genes putativos de virulência quando provenientes de infecção intracelular. A cepa EDL 931 mostrou em 24 horas de infecção aumento na transcrição de genes relevantes para resistência ao stress oxidativo (soxR) e ácido (gadE), genes da adesina Lpf1 e genes associados à sobrevivência intracelular (pagC) e à inibição da apoptose e mitigação da resposta inflamatória da célula hospedeira (nleD). Já a cepa prototípica EDL 933, apresentou em 2 horas repressão na expressão dos genes investigados, com exceção de ler, porém em 24 horas mostrou aumento na transcrição de genes relacionados à captação de ferro (como chuA e iha), resistência ao stress oxidativo (soxR) e gene da adesina Lpf2. Para ambas as cepas, durante a infecção intracelular ocorreu repressão na transcrição de stx2a, sugerindo que a localização intracelular de EHEC O157:H7 em células Caco-2 determina a repressão na transcrição do gene da subunidade A da toxina Stx2. Nossos achados sugerem que diferentes cepas de EHEC O157:H7 respondem de forma distinta a estímulos que transcorrem no contexto de uma infecção intracelular.