Deleção direcionada de centrina em Leishmania Braziliensis utilizando CRISPR-Cas9: geração de uma linhagem atenuada para imunoprofilaxia
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Data de Publicação: | 2023 |
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Texto Completo: | https://repositorio.ufba.br/handle/ri/37878 |
Resumo: | As Leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas e não exitem vacinas para uso humano. Na América Latina, a Leishmania braziliensis é o principal agente causador da leishmaniose tegumentar. Aqui, visando o desenvolvimento de uma cepa atenuada de L. braziliensis com fins de imunoprofilaxia, nós empregamos a tecnologia CRISPR/Cas9 com sucesso. Geramos uma linhagem de parasitas transgênicos expressando Cas9 e T7 RNA polimerase, a qual foi empregada para a deleção direcionada de centrina, uma proteína do citoesqueleto envolvida na duplicação do centrossoma em eucariotos. O sequenciamento do genoma completo de L. braziliensis deficiente em centrina (LbCen-/-) não indicou a presença de mutações fora do alvo. In vitro, as taxas de crescimento de promastigotas de LbCen-/- e de tipo selvagem foram semelhantes, mas os amastigotas axênicos e intracelulares de LbCen-/- mostraram um fenótipo multinucleado, com sobrevivência diminuída em macrófagos infectados. Após a inoculação experimental em camundongos BALB/c, a LbCen-/- não induziu o desenvolvimento de lesões e os parasitas foram eliminados rapidamente. Porém, a imunização com LbCen-/- não conferiu proteção contra um desafio subsequente, diferentemente de outras linhagens com esta mesma deficiência. A resposta imune induzida pela inoculação com LbCen-/- foi caracterizada por níveis significativamente mais elevados de IL-4 e IL-10, não observados em camundongos leishmanizados com LbWT. Portanto, a imunização com LbCen-/- não é capaz de induzir uma resposta imune do tipo Th1, tornando os camundongos suscetíveis a desafios e a LbCen-/- não pode reproduzir a imunidade observada na leishmanização. Em conclusão, a deficiência da centrina em L. braziliensis causa atenuação do parasita, interrompe a capacidade de causar doença, mas não é capaz de estimular uma resposta imune protetora. |
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2023-09-26T13:30:54Z2023-09-26T13:30:54Z2023-07-11https://repositorio.ufba.br/handle/ri/37878As Leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas e não exitem vacinas para uso humano. Na América Latina, a Leishmania braziliensis é o principal agente causador da leishmaniose tegumentar. Aqui, visando o desenvolvimento de uma cepa atenuada de L. braziliensis com fins de imunoprofilaxia, nós empregamos a tecnologia CRISPR/Cas9 com sucesso. Geramos uma linhagem de parasitas transgênicos expressando Cas9 e T7 RNA polimerase, a qual foi empregada para a deleção direcionada de centrina, uma proteína do citoesqueleto envolvida na duplicação do centrossoma em eucariotos. O sequenciamento do genoma completo de L. braziliensis deficiente em centrina (LbCen-/-) não indicou a presença de mutações fora do alvo. In vitro, as taxas de crescimento de promastigotas de LbCen-/- e de tipo selvagem foram semelhantes, mas os amastigotas axênicos e intracelulares de LbCen-/- mostraram um fenótipo multinucleado, com sobrevivência diminuída em macrófagos infectados. Após a inoculação experimental em camundongos BALB/c, a LbCen-/- não induziu o desenvolvimento de lesões e os parasitas foram eliminados rapidamente. Porém, a imunização com LbCen-/- não conferiu proteção contra um desafio subsequente, diferentemente de outras linhagens com esta mesma deficiência. A resposta imune induzida pela inoculação com LbCen-/- foi caracterizada por níveis significativamente mais elevados de IL-4 e IL-10, não observados em camundongos leishmanizados com LbWT. Portanto, a imunização com LbCen-/- não é capaz de induzir uma resposta imune do tipo Th1, tornando os camundongos suscetíveis a desafios e a LbCen-/- não pode reproduzir a imunidade observada na leishmanização. Em conclusão, a deficiência da centrina em L. braziliensis causa atenuação do parasita, interrompe a capacidade de causar doença, mas não é capaz de estimular uma resposta imune protetora.Leishmaniases are neglected tropical diseases and there are no vaccines for human use. In Latin America, Leishmania braziliensis is the main causative agent of tegumentary leishmaniasis. Here, aiming at the development of an attenuated strain of L. braziliensis for immunoprophylaxis purposes, we successfully employed the CRISPR/Cas9 technology. We generated a line of transgenic parasites expressing Cas9 and T7 RNA polymerase, which was employed for the targeted deletion of centrin, a cytoskeletal calcium-binding protein involved in centrosome duplication in eukaryotes. Whole genome sequencing of centrin deficient L. braziliensis (LbCen-/-) did not indicate the presence of off-target mutations. In vitro, growth rates of LbCen-/- and wild-type promastigotes were similar, but axenic and intracellular LbCen-/- amastigotes showed a multinucleated phenotype with impaired survival in infected macrophages. After experimental inoculation in BALB/c mice, LbCen-/- failed to induce lesion development and the parasites were rapidly eliminated. Furthermore, immunization with LbCen-/- did not confer protection against subsequent challenges, unlike other centrin-deficient leishmanias. The immune response induced by inoculation with LbCen-/- was characterized by significantly higher levels of IL-4 and IL-10, not observed in mice leishmanized with LbWT. Therefore, immunization with LbCen-/- is not capable of inducing a Th1-type immune response, making mice susceptible to challenges, and LbCen-/- cannot reproduce the immunity observed in leishmanization. In conclusion, centrin deficiency in L. braziliensis causes parasite attenuation, interrupts the ability to cause disease, but otherwise cannot stimulate a protective immune response.Submitted by Francys Rangel (francysav.rangel@gmail.com) on 2023-09-22T13:00:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese Doutorado Francys Rangel.pdf: 4076096 bytes, checksum: 37eed518b69e0dda7bc6e90285db96ca (MD5)Approved for entry into archive by Edvaldo Souza (edvaldosouza@ufba.br) on 2023-09-26T13:30:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese Doutorado Francys Rangel.pdf: 4076096 bytes, checksum: 37eed518b69e0dda7bc6e90285db96ca (MD5) license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5)Made available in DSpace on 2023-09-26T13:30:54Z (GMT). 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