Papel do colesterol na criotolerância e viabilidade de embriões bovinos produzidos in vitro com diferentes cinéticas de desenvolvimento

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Annes, Kelly
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFABC
Texto Completo: http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=120837
Resumo: Orientadora: Profa. Dra. Marcella Pecora Milazzotto
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Para o primeiro estudo, os oócitos foram maturados in vitro, fertilizados e, no momento da cultura in vitro, os zigotos foram divididos em 3 grupos: Ctrl - controle, Sinv - inibição (sinvastatina) e IGF-1 - estimulação (IGF). Os blastocistos foram coletados no D7 e submetidos à quantificação dos lipídios (Sudan Black B e Nile Red), à fragmentação nuclear e ao ensaio do número total de células (TUNEL), apoptose (Caspase-3), vitrificação e perfil lipídico e metabólico (RMN). O perfil lipídico e metabólico do meio de cultura também foi avaliado por RMN. As taxas de clivagem e blastocisto, Sudan Black B, TUNEL e Caspase foram analisadas por ANOVA e teste de Tukey. Os dados de RMN foram submetidos à análise discriminante por mínimos quadrados parciais dispersos (sPLS-DA) pelo software MetaboAnalyst2.0 e as taxas de sobrevida, desenvolvimento e eclosão pósaquecimento foram comparadas pelo teste de Qui-quadrado. A inibição do CBP teve efeitos deletérios no desenvolvimento e qualidade do embrião, uma vez que as taxas de clivagem e blastocisto foram menores no grupo Sinv e percentual de fragmentação nuclear e o conteúdo lipídico total aumentou quando comparado ao Ctrl e ao IGF-1 (P <0,05). Por outro lado, embriões derivados do grupo IGF-1 apresentaram menos células apoptóticas, evidenciadas por menor fragmentação nuclear e atividade de caspase-3 quando comparados a Ctrl e Sinv. A modulação da CBP teve influência no metabolismo lipídico geral, uma vez que todas as classes de lipídeos apresentaram maior abundância em blastocistos do grupo Ctrl, com exceção do ômega-3 que foram aumentados nos grupos IGF-1 e Sinv e colesterol que diminuiu no grupo Sinv, como esperado (P <0,05). A análise lipídica do meio de cultura revelou que a abundância relativa de ácidos graxos e colesterol foram menores e ômega-3 e triglicerídeos foram maiores no grupo IGF-1 (P <0,05) quando comparado a Ctrl e Sinv. As análises de metabolitos em embriões e meios de cultivo, também apresentaram perfis característicos para os grupos. Embriões Sinv apresentaram menor abundância relativa de metabólitos e foi o grupo que mais capturou recursos do meio de cultivo. Essas alterações na viabilidade celular assim como do metabolismo levaram a uma taxa de sobrevivência diminuída após a criopreservação para o grupo Sinv (P <0,05). Esses dados nos permitem concluir que a CBP é crucial para a manutenção de diferentes funções celulares. A inibição desta via resulta na diminuição da qualidade embrionária e na sobrevivência após a criopreservação. Para o segundo estudo, os embriões foram classificados quanto a cinética de desenvolvimento as 40hpi, coletados no estágio de blastocisto e avaliados quanto: ao conteúdo lipídico (Sudan Black B.), perfil lipídico (espectrometria de massas - MS), a quantificação de transcritos relacionados ao metabolismo lipídico, metabolismo energético, estresse oxidativo, sinalização, diferenciação e morte celular (qRT-PCR), e número de células totais. Embriões rápidos apresentaram maior conversão à blastocisto. O IGF-1 não atingiu as expectativas do estudo em relação a modulação da via de biossíntese do colesterol. No entanto, embriões rápidos parecem ter um metabolismo mais calmo após a exposição ao IGF-1, o que poderia ser uma vantagem a eventos posteriores, por diminuírem o estresse que esses embriões estão submetidos. Outro fato é que independentemente do modulador a que os embriões foram expostos, as conversões a blastocisto permaneceram inalteradas, o que nos leva a hipótese de que o que determina a conversão a blastocisto são outros fatores, incluindo àqueles ligados a cinética embrionária. A sinvastatina não interferiu nas taxas de blastocisto, porém modulou a maquinaria celular dos embriões expostos independentemente da cinética, os deixando menos ativos e com prejuízo no número de células. Esses embriões foram capazes de capturar colesterol do meio de cultivo e estocá-los para ser recrutado de acordo com a demanda. Desse modo, o resultado do bloqueio da HMG-CoA redutase, parece ter sido sutil nesse tratamento, pois esses embriões puderam retirar recursos do meio de cultivo. Porém, suas vias de sinalização para sobrevivência parecem ter sido prejudicadas, fato notado pela baixa expressão relativa de genes de resposta ao estresse, morte, sinalização e diferenciação celular.Phospholipids and cholesterol are the main constituents of membranes and their distribution pattern and abundance may affect the membrane fluidity, permeability and thermal phase behavior, characteristics that are fundamental in cryopreservation. In this study, we modulated the cholesterol biosynthesis pathway (CBP) throughout the in vitro embryo development and characterize its impact on embryo viability of bovine embryos with and without developmental kinetics stratification. For an initial study, oocytes were in vitro matured, fertilized and, at the timing of in vitro culture, the zygotes were divided in 3 groups: Ctrl - control, Sinv - inhibition (simvastatin) and IGF-1 - stimulation (IGF). Blastocysts were collected at day 7 and s submitted to lipid quantification (Sudan Black B and Nile Red), nuclear fragmentation and total cell number (TUNEL), apoptosis (Caspase-3), vitrification and lipid and metabolic profile ( NMR). Lipid and metabolic profile of the culture medium was also assessed by NMR. Cleavage and blastocyst rates, Sudan Black B, TUNEL and Caspase were analyzed by ANOVA and Tukey post test. NMR data were subjected to partial least squares discriminant analysis sparse (sPLS-DA) by using MetaboAnalyst2.0 and survival, development and hatching rates post-warming were compared by the Chisquare test. Inhibition of CBP had deleterious effects on embryo development and quality, since cleavage and blastocyst rates were lower in the Sinv group and percentage of nuclear fragmentation and total lipid content were increased when compared to Ctrl and IGF-1 (P <0.05). On the other hand, embryos derived from the IGF-1 group presented less apoptotic cells, evidenced by lower nuclear fragmentation and caspase-3 activity when compared to Ctrl and Sinv. Modulation of CBP had influence on the overall lipid metabolism, since all lipid classes presented higher relative abundance in blastocysts from Crtl group, except for omega-3 that were increased in IGF-1 and Sinv groups and cholesterol that decreased in group Sinv, as expected (P <0.05). The lipidome analysis of the spent culture medium revealed that the relative abundance of fatty acids and cholesterol were lower and omega-3 and triglycerides were higher in the IGF-1 group (P <0.05) when compared to Ctrl and Sinv. Analyzes of metabolites in embryos and spent culture media also presented characteristic profiles for the groups. Sinv embryos had lower relative abundance of metabolite and was the group that most captured substrate from the culture medium. These changes in cellular viability as well as lipid metabolism led to a diminished survival rate after cryotopreservation for Sinv group (P<0.05). These data allow us to conclude that the CBP is crucial for the maintenance of different cellular functions. Inhibition of this pathway results in diminished embryonic quality and survival after cryopreservation. For the second study, the embryos were classified as developmental kinetics at 40hpi, collected at the blastocyst stage and evaluated for: lipid content (Sudan Black B), lipid profile (mass spectrometry - MS), quantification of transcripts related to lipid metabolism, energy metabolism, oxidative stress, signaling, differentiation and cell death (qRT-PCR), and total cell number. Rapid embryos showed greater conversion to blastocyst. IGF-1 did not meet the expectations of the study regarding modulation of the CBP. However, fast embryos appear to have a quiet metabolism after exposure to IGF-1, which could be an advantage to later events by decreasing the stress that these embryos are undergoing. Another fact is that regardless of the modulator to which the embryos were exposed, blastocyst conversions remained unchanged, leading us to the hypothesis that what determines blastocyst conversion are other factors, including those related to embryonic kinetics. Simvastatin did not interfere with blastocyst rates, but modulated the cellular machinery of exposed embryos regardless of kinetics, leaving them less active and impairing cell numbers. These embryos were able to capture cholesterol from the culture medium and stock them to be recruited according to demand. Thus, the result of inhibition of HMG-CoA reductase seems to have been subtle in this treatment, as these embryos were able to take substrates from the culture medium. However, their signaling pathways for survival seem to have been impaired, a fact noted by the low relative expression of stress response genes, death, signaling and cell differentiation.Milazzotto, Marcella PecoraGasparrini, BiancaSudano, Mateus JoseVecchio, DomenicoGoissis, Marcelo DemarchiAnnes, Kelly2019info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf173 f. : il.http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=120837http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=120837&midiaext=78040http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=120837&midiaext=78039Cover: http://biblioteca.ufabc.edu.br/php/capa.php?obra=120837porreponame:Repositório Institucional da UFABCinstname:Universidade Federal do ABC (UFABC)instacron:UFABCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2022-03-25T16:29:53Zoai:BDTD:120837Repositório InstitucionalPUBhttp://www.biblioteca.ufabc.edu.br/oai/oai.phpopendoar:2022-03-25T16:29:53Repositório Institucional da UFABC - Universidade Federal do ABC (UFABC)false
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