Caracterização bioquímica e molecular da oxidase alternativa de fruto de graviola (Annona muricata L.) durante o amadurecimento pós-colheita

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Brasil, Isabella Montenegro
Data de Publicação: 2002
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC)
Texto Completo: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/71449
Resumo: Este documento está disponível online com base na Portaria nº 348, de 08 de dezembro de 2022, disponível em: https://biblioteca.ufc.br/wp-content/uploads/2022/12/portaria348-2022.pdf, que autoriza a digitalização e a disponibilização no Repositório Institucional (RI) da coleção retrospectiva de TCC, dissertações e teses da UFC, sem o termo de anuência prévia dos autores. Em caso de trabalhos com pedidos de patente e/ou de embargo, cabe, exclusivamente, ao autor(a) solicitar a restrição de acesso ou retirada de seu trabalho do RI, mediante apresentação de documento comprobatório à Direção do Sistema de Bibliotecas. (Faltam as seguintes páginas: ii, iii, iv e v.)
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spelling Caracterização bioquímica e molecular da oxidase alternativa de fruto de graviola (Annona muricata L.) durante o amadurecimento pós-colheitaGraviola - AnáliseBioquímicaEste documento está disponível online com base na Portaria nº 348, de 08 de dezembro de 2022, disponível em: https://biblioteca.ufc.br/wp-content/uploads/2022/12/portaria348-2022.pdf, que autoriza a digitalização e a disponibilização no Repositório Institucional (RI) da coleção retrospectiva de TCC, dissertações e teses da UFC, sem o termo de anuência prévia dos autores. Em caso de trabalhos com pedidos de patente e/ou de embargo, cabe, exclusivamente, ao autor(a) solicitar a restrição de acesso ou retirada de seu trabalho do RI, mediante apresentação de documento comprobatório à Direção do Sistema de Bibliotecas. (Faltam as seguintes páginas: ii, iii, iv e v.)The development and maturation of fruits has received considerable scientific scrutiny of both the uniqueness of such processes to the biology of plants and the importance of fruit as a significant component of the human diet. Molecular and genetic analysis of fruit development, and especially ripening of freshy fruits, has resulted in significant gains in knowledge over recent years finding in areas of fruit primary development regulation and common regulatory mechanisms among climacteric and nonclimacteric ripening in addition to identification of discrete molecular mechanisms specific to unique fruit development traits that differentiate fruiting species. Climacteric fruits are defined by a respiratory burst during the ripening process and this climacteric burst was associated with an enhanced activity of the alternative pathway, that is nonphosphorylating and cyanide-resistant, mediated by alternative oxidase (AOX), which physiological role in plant respiration and metabolism is still largely unknown. In the present work, it has been standardized soursop (Annona muricata L. cv. 'Morada') fruit pulp mitochondria isolation and purification techniques from unripe and ripe fruit. Fruits from commercial orchard in Quixeré, Ceará State/Brazil were divided into six groups of five fruit each and stored at room temperature (24,5 + 0,5°C; 80-85% R.H) for up 8 days. Respiration rate, ethylene production and physical-chemistry and chemical characterization were determined during soursop ripening. Soursop fruit pulp mitochondria were isolated ( purified on Percoll gradient) and characterized concerning biochemistry properties through substrates oxidation, respiratory control and ADP/0 relation. Electron alternative pathway was measured in the presence of cyanide. Oxygen uptake was polarographycally estimated using NADH, succinate and malate/glutamate as a substrates. Molecular and genetic analysis such as genomic DNA extraction, total RNA from unripe and ripe fruit, PCR analysis for amplification of AOX gene using heterologous primers for gene number identification and sequence analysis from cloned PCR product as well as RFLP analysis for investigate the AOX clones polimorphism and analysis of AOX gene expression through immunoblotting using antibodies against AOX Sauromattum guttatum and cDNA obtained through total RNA extraction from unripe and ripe soursop fruit pulp using RT-PCR were also realized. The alternative pathway activity was detected in unripe and ripe soursop fruit mitochondria and its activity was at least 2 times higher in ripe soursop fruit mitochondria than in unripe fruit. The CO2 and ethylene production peak coincided with the climacteric and occurred at the same time as an increase in alternative electron transport. The unripe soursop fruit mitocondria AOX activity was modulated by the pyruvate in the presence of NADH as a substrate. The immunoblotting results showed a presence of only one protein of approximately 34kDa in soursop fruit mitochondria at days 1 to 4 postharvest and from days 5 to 8, three proteins of ca. 32, 34 and 36kDa, were detected. Two bands (32 and 34kDa) were found 5 and 6 days postharvest, and the third band (36kDa) at days 7 and 8 postharvest. The presence of various isoforms detected in the soursop fruit mitochondria isolated during the postharvest ripening suggested possibly the presence of a multigene family for the AOX in soursop fruit which was expressed differentially during development. The increaese of AOX activity comparable to the AOX expression profile and accumulation of new reduced protein bands in the soursop fruit mitochondria isolated during postharvest ripening (1 to 8 days) suggested that there is a AOX modulation associated to the climacteric ripening of this fruit.O desenvolvimento e maturação dos frutos tem recebido considerável atenção devido a peculiaridade de tais processos para a Biologia Vegetal e da importância dos frutos como um componente significante da dieta humana. Nos últimos anos a aplicação de análises genéticas e moleculares do desenvolvimento dos frutos, e especialmente do processo de amadurecimento de frutos frescos, tem resultado em ganhos significativos para a elucidação da regulação primária do desenvolvimento de frutos e mecanismos regulatórios comuns do amadurecimento de frutos climatéricos e não climatéricos em adicão aos mecanismos moleculares específicos de desenvolvimento que caracteriza as diferentes espécies de fruto. Os frutos climatéricos são caracterizados pela presença de uma explosão respiratória no processo do amadurecimento sendo tal respiração associada a presença de uma via alternativa de transporte de elétrons, não fosforilante e insensível ao cianeto, modulada pela oxidase alternativa (AOX), cujo papel fisiológico no metabolismo celular ainda não foi definitivamente esclarecido. No presente trabalho foram padronizadas técnicas de isolamento e purificação da fração mitocondrial de polpa de frutos de graviola (Anona inuricala L.), da variedade 'Morada' obtidos de pomar comercial no município de Quixeré, no estado do Ceará - Brasil, no estádio verde e maduro. Os frutos foram divididos aleatoriamente em 06 grupos de 05 frutos e estocados em temperatura ambiente (24,5 + 0,5 "C; 80-85% U.R.) durante 08 dias. Foram efetuadas as análises da medida da taxa respiratória e produção de etileno e caracterização fisico-química e química da polpa durante um período de 1 a 8 dias após a colheita. As frações mitocondriais da polpa de frutos de graviola nos dois estádios de maturação ( "verde" e "maduro") foram isoladas (purificadas em gradiente Percoll) e caracterizadas do ponto de vista bioquímico, através da oxidação de substratos, controle respiratório e da relação ADP/O. A atividade da oxidase foi medida através do consumo de oxigênio insensível ao cianeto, usando-se como substratos oxidáveis, NADH, succcinato e malato/glutamato. Análises genéticas e moleculares tais como extração de DNA genômico, de RNA total de frutos nos dois estádios de maturação ('verde" e "maduro"), amplificação do gene da oxidase alternativa de Annona muricata a partir do DNA genômico utilizando "primers" heterólogos para análise de número de genes, e seqüenciamento do gene da AOX a partir de clonagem, análises de RFLP para averiguar polimorfismo nos clones da oxidase alternativa, bem cono análises da expressão do gene da oxidase alternativa através de "immunoblotting" usando anticorpos contra AOX de Sauromatum guttatum e obtenção de cDNA a partir de RNA total extraído de polpa de fruto de graviola "verde" e "madura" através de RT-PCR foram também realizadas. Detectou-se a participação da via alternativa de transporte de elétrons nas frações mitocondriais de polpa de frutos de graviola (Annona muricata L.) no estádio verde e maduro através da atividade da AOX, que apresentou-se ser no mínimo 02 vezes maior em mitocondriais de polpa de fruto no estádio maduro quando comparada a de fruto "verde". O pico de produção de CO2 e etileno, coincidente com o climatério respiratório, ocorreu ao mesmo tempo do aumento de consumo de oxigênio pela via alternativa de transporte de elétrons. A oxidase alternativa de mitocôndrias de polpa de frutos de graviola no estádio "verde" revelou-se modulada pelo piruvato em presença de NADH como substrato. Os resultados dos "immunoblottings", revelam a presença de sómente 01 proteína ca. 34kDa em frutos até 04 dias pós-colheita, correspondente a forma reduzida (forma ativa). Em frutos do dia 5° até o 8° dia pós-colheita (senescência), os anticorpos reconheceram 03 proteínas com massas moleculares aparentes ca. 32, 34 e 36 lcDa, sendo que 02 delas (32 e 34 lcDa) estavam presentes no 5° e no 6° dia pós-colheita e as 3 bandas (32, 34 e 36 kDa) estavam presentes no 7° e 8° dia pós-colheita.. A presença de várias isoformas da AOX detectadas nas frações mitocondriais de Annona muricata L., isoladas ao longo do amadurecimento pós-colheita dos frutos (1 a 8 dias) deve-se possivelmente a existência de uma família multigênica que é diferentemente expressada durante o processo de desenvolvimento. O aumento de atividade da AOX correlacionado com o perfil de expressão e acumulação de novas bandas protéicas reduzidas, nas frações mitocondriais de Annona muricata L., isoladas ao longo do amadurecimento pós-colheita dos frutos (1 a 8 dias), sugere uma modulação da AOX associada ao amadurecimento climatérico desse fruto.Melo, Dirce Fernandes deBrasil, Isabella Montenegro2023-03-24T19:24:29Z2023-03-24T19:24:29Z2002info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfBRASIL, Isabella Montenegro. Caracterização bioquímica e molecular da oxidase alternativa de fruto de graviola (Annona muricata L.) durante o amadurecimento pós-colheita. 2002. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2002.http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/71449porreponame:Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC)instname:Universidade Federal do Ceará (UFC)instacron:UFCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2023-03-24T19:24:29Zoai:repositorio.ufc.br:riufc/71449Repositório InstitucionalPUBhttp://www.repositorio.ufc.br/ri-oai/requestbu@ufc.br || repositorio@ufc.bropendoar:2024-09-11T18:17:54.649271Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC) - Universidade Federal do Ceará (UFC)false
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