CaracterizaÃÃo bioquÃmica e atividades biolÃgicas de quitinases laticÃferas de Calotropis procera

• Autor(a) principal: Carolina de AraÃjo Viana
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC
• Texto Completo: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=15513
• topic: Defesa vegetal; LÃtex; ProteÃnas; ProspecÃÃo biotecnolÃgica; Bioteconologia vegetal; Plant defense; Latex; Proteins; Biotechnology prospection; BIOQUIMICA

Calotropis procera à uma planta laticÃfera, pertencente à famÃlia Apocynaceae. ProteÃnas de defesa foram descritas no lÃtex com atividade contra insetos fitÃfagos e fungos fitopatogÃnicos. A fraÃÃo proteica do lÃtex tambÃm apresenta atividades farmacolÃgicas, dentre tais efeito citotÃxico seletivo em cÃlulas carcinogÃnicas. A partir da fraÃÃo proteica efetiva sobre cÃlulas neoplÃsicas, o trabalho teve por meta central identificar proteÃna(s) citotÃxica(s) e proceder a sua caracterizaÃÃo bioquÃmica, biolÃgica e suas perspectivas biotecnolÃgicas. As proteÃnas solÃveis do lÃtex (PL) foram fracionadas em matriz de troca iÃnica e a fraÃÃo proteica detentora da citotoxicidade foi refracionada em outra matriz de troca iÃnica (Mono-Q) acoplada a sistema de mÃdia pressÃo. P4 foi identificado como a fraÃÃo citotÃxica, apresentando uma IC50 de 2,2, 1,2 e 2,9 Âg/mL para as linhagens celulares HCT-116, Ovcar-8 e SF-295, respectivamente. A anÃlise proteÃmica da fraÃÃo citotÃxica por eletroforese bidimensional permitiu identificar 15 spots, contendo proteÃnas Ãcidas (pI entre 4 e 6) e com massa molecular aparente de 30 kDa. Quando avaliados por espectrometria de massas todos esses spots foram identificados como quitinases e apresentaram massa intacta de 27,4 kDa. A amostra reagiu positivamente ao reagente de Schiff, sugerindo glicosilaÃÃes. O teor de carboidratos foi estimado em 12,8%. A sequÃncia amino terminal obtida (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revelou 50% de similaridade com quitinases de Solanum lycopersicum, Oryza sativa, Nicotiana tomentosiformes dentre outras. As enzimas apresentaram forte atividade quitinolÃtica, com pH Ãtimo variando entre 5-6 e temperatura Ãtima de 25 ÂC. A atividade quitinolÃtica foi reduzida quando tratada com concentraÃÃes crescentes de DTT (3, 10 e 30 mM) o que sugere a presenÃa de pontes dissulfeto estabilizadoras da enzima. AnÃlises por dicroÃsmo circular indicam a presenÃa majoritÃria de alfa-hÃlices na estrutura e que as isoformas se mostraram pouco resistentes a variaÃÃes de temperatura e pH. Imagens de alta resoluÃÃo geradas por microscopia de forÃa atÃmica sugeriram homogeneidade na amostra e um arranjo hexamÃrico foi evidenciado. As quitinases nÃo inibiram o crescimento micelial dos fungos fitopatogÃnicos Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloeosporioides, mas reduziram a germinaÃÃo de esporos de C. gloeosporioides. Em consonÃncia as quitinases nÃo induziram estresse oxidativo nos esporos, mas causaram leves alteraÃÃes na permeabilidade membranar dos esporos avaliados. As quitinases laticÃferas (0,1 % m/m) apresentaram forte efeito deletÃrio sobre o inseto fitÃfago Callosobruchus maculatus. Os efeitos produziram 57% de reduÃÃo na sobrevivÃncia larval, reduÃÃo do peso de larvas (7,8 mg  0,2 /4,0  0,8) e emergÃncia de insetos adultos (50%), alÃm de prolongar de 28 para 33 dias o tempo mÃdio de desenvolvimento de insetos adultos. As quitinases (2 mg/Kg, e.v.) apresentaram forte atividade anti-inflamatÃria, reduzindo em 95% a infiltraÃÃo de neutrÃfilos na cavidade peritoneal em ensaio de inflamaÃÃo induzido por carragenina em camundongos. Este efeito foi revertido por L-NAME e Aminoguanidina, dois inibidores da enzima Ãxido nÃtrico sintase, indicando o possÃvel envolvimento do Ãxido nÃtrico no efeito observado. Esta aÃÃo foi associada à reduÃÃo dos nÃveis das citocinas prÃ-inflamatÃrias TNF-α e IL-1 na cavidade peritoneal e do aumento dos nÃveis sÃricos das citocinas prÃ-inflamatÃrias TNF-α, IL-6 e IL-1. à concluÃdo que vÃrias isoformas de quitinases coexistem no lÃtex de C. procera. Estas proteÃnas atuam possivelmente na defesa contra insetos, mas tÃm pouca aÃÃo contra fungos. As quitinases laticÃferas foram identificadas como as proteÃnas citotÃxicas do lÃtex sobre cÃlulas neoplÃsicas e ainda foram capazes de modular os nÃveis de citocinas prÃ-inflamatÃrias e sÃntese de Ãxido nÃtrico em modelo de inflamaÃÃo aguda. As quitinases do lÃtex de C. procera representam interessantes molÃculas para prospecÃÃo biotecnolÃgica em defesa vegetal e farmacologia.