ExpressÃo heterÃloga, caracterizaÃÃo cristalogrÃfica e anÃlise funcional de uma osmotina antifÃngica de Calotropis procera

• Autor(a) principal: Raquel Sombra BasÃlio de Oliveira
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC
• Texto Completo: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=13438
• topic: cDNA; Cristalografia; LÃtex; ProteÃna recombinante; Crystallography; Latex; Recombinant proteins; BIOQUIMICA

Em etapa anterior a este trabalho, uma proteÃna purificada a partir do lÃtex da planta Calotropis procera foi purificada e sua caracterizaÃÃo bioquÃmica revelou ser esta uma proteÃna similar a osmotinas e que a mesma, denominada de CpOsm, exibia forte atividade contra fungos fitopatogÃnicos. Neste trabalho foram investigados sistemas de expressÃo heterÃlogos, procarionte e eucarionte, com o objetivo de estabelecer sistemas de expressÃo que pudessem produzir CpOsm recombinante e avaliar se sua expressÃo produzia a proteÃna ativa, com aÃÃo antifÃngica. A partir do sequenciamento do cDNA da CpOsm e ensaios de cristalizaÃÃo desenvolvidos com a proteÃna purificada do lÃtex foi possÃvel estudar suas caracterÃsticas moleculares. Para a expressÃo em E. coli foi utilizado o vetor pET303CT-His e P. pastoris o vetor pPICZαA. A proteÃna recombinante (rCpOsm) expressa no sistema procarionte nÃo foi secretada para o meio externo, acumulando-se no espaÃo intracelular, formando corpos de inclusÃo, nos quais a proteÃna estava insolÃvel. Embora a insolubilidade represente um passo limitante, este sistema de expressÃo pode ser muito interessante para a produÃÃo quantitativa de rCpOsm para outros fins como produÃÃo de anticorpos ou estudos de folding/refolding proteico, considerado suas caracterÃsticas moleculares peculiares, observadas nos estudos cristalogrÃficos, tais como o conjunto de pontes dissulfeto intracadeia. rCpOsm foi tambÃm expressa em cÃlulas de P. pastoris, entretanto o sistema de expressÃo deverÃ, necessariamente, sofrer melhorias para maximizar o rendimento. rCpOsm de P. pastoris foi inicialmente detectada por sequenciamento de novo por espectrometria de massas a partir da digestÃo trÃptica. A identificaÃÃo de peptÃdeos internos confirmou sua presenÃa no meio extracelular. A limitaÃÃo deu-se pela baixa taxa de expressÃo, o que, por conseguinte, nÃo permitiu uma caracterizaÃÃo mais ampla da rCpOsm deste sistema. rCpOsm expressa em P. postoris estava em sua forma ativa. Em uma anÃlise comparativa, rCpOsm e CpOsm, de modo e intensidade similares, foram capazes de alterar drasticamente a morfologia de esporos de F. solani e reduzir seu volume, comparados a esporos nÃo tratados, revelado atravÃs de microscopia de forÃa atÃmica. CpOsm foi cristalizada pelo mÃtodo de gota pendente e os cristais obtidos difrataram a uma resoluÃÃo de 1,61 à com caracterÃsticas morfolÃgicas do espaÃo cristalogrÃfico P6122. Os dados coletados sugerem que a proteÃna mantÃm uma estrutura em monÃmero, correspondendo a sequÃncia de aminoÃcidos do cDNA, com 203 resÃduos. A estrutura pode ser vista como trÃs regiÃes distintas, presentes em outras osmotinas jà descritas, formando um domÃnio central onde hà um conjunto de folhas beta, sendo este o mais longo, e dois outros menores, formados de estrutura predominantemente desordenadas com pequenos segmentos em alfa-hÃlice (domÃnio II) e longas alÃas (domÃnio III). Oito pontes dissulfeto estabilizam a estrutura e envolvem todos os resÃduos de cisteÃna da estrutura primÃria. NÃo hà evidencias cristalogrÃficas para formaÃÃo de oligÃmeros. Este estudo conclui que a expressÃo heterÃloga em sistema eucarionte produz rCpOsm ativa e isto representa uma etapa a mais cumprida para a sua possÃvel expressÃo em plantas com o objetivo de proteÃÃo contra fitopatÃgenos.