Heterologous expression of a glycoside hydrolase Family 18 (cv2736) of Chromobacterium violaceum in Pichia pastoris with potential antibacterial

• Autor(a) principal: Suelen Carneiro de Medeiros
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC
• Texto Completo: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=8460
• topic: quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; expressÃo heterÃloga; BIOQUIMICA

Quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarÃdeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que à extremamente abundante na natureza. ApÃs o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteÃnas com potencial biotecnolÃgico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteÃna CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em cÃlulas de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importÃncia mÃdica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteÃna truncada, sem um possÃvel peptÃdeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressÃo pPICZαA, para expressÃo em P. pastoris KM71H. A proteÃna completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fraÃÃo proteica, contendo as proteÃnas secretadas para o meio de cultura, por cÃlulas de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressÃo recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogÃnea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo trÃs bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoÃcidos. ApÃs coloraÃÃo com reagente de Schiff para revelaÃÃo de glicoproteÃnas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. AlÃm disso, rCV2736PS+ teve seus peptÃdeos identificados por espectrometria de massas, na fraÃÃo F0/95 do meio de cultura livre de cÃlulas. A proteÃna recombinante produzida sem os 22 aminoÃcidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinÃsica maior que a encontrada para a fraÃÃo contendo rCV2736PS+, apesar de nÃo ter sido detectada por SDS-PAGE. A fraÃÃo F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestÃvel atà 50ÂC e com pico de atividade quitinolÃtica em pH 3,0. A mesma fraÃÃo apresentou maior atividade endoquitinÃsica e ativa contra os substratos sintÃticos 4-nitrofenil N,Nââdiacetil-β-D-quitobiosÃdeo e 4-nitrofenil N,Nâ,Nâââtriacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), tÃpico das proteÃnas da famÃlia GH18. Do mesmo modo, a fraÃÃo F0/95 foi testada contra seis espÃcies de bactÃrias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fraÃÃo foi testada contra a levedura Candida albicans, mas nÃo foi detectada inibiÃÃo do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteÃna recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molÃcula com potencial antibacteriano. Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; ExpressÃo heterÃloga.