Rastreamento molecular por pirosequenciamento de mutações relacionadas à resistência a Lamivudina em subpopulações de HBV e HIV isoladas de pacientes coinfectados

• Autor(a) principal: Dias, Natália Spitz Toledo
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense (RIUFF)
• Texto Completo: https://app.uff.br/riuff/handle/1/5200
• topic: HBV; Lamivudina; HIV; Vírus da hepatite B; HIV; Lamivudina; Lamivudine

Aproximadamente 10% dos indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) são portadores crônicos do vírus da hepatite B (HBV). O monitoramento destes pacientes merece atenção especial, já que estes progridem mais rápido para cirrose e morte por doença hepática do que os monoinfectados pelo HBV. Por esse motivo, a terapia antiviral contra os dois vírus é prioritária na maioria dos casos. Algumas drogas atuam na transcriptase reversa (TR), enzima importante na replicação de ambos os vírus e, por isso, podem ser eficazes no tratamento das duas infecções. No entanto, mutações de resistência podem ser selecionadas durante a terapia, levando a diminuição da eficácia das drogas utilizadas. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar as mutações de resistência à Lamivudina (3TC) em populações de HBV e HIV isoladas de pacientes coinfectados, através da técnica de pirosequenciamento. Quarenta e cinco amostras de soro de pacientes HBV/HIV coinfectados foram submetidas à análise da mutação primária rtM204V/I e das compensatórias rtV173L e rtL180M do HBV e da mutação M184V/I do HIV-1. Todas as amostras foram submetidas a um ensaio de nested-PCR para amplificação de um fragmento da polimerase viral do HBV e a um RT-PCR para amplificação da região da TR do HIV-1. Vinte e cinco amostras foram amplificadas com sucesso para o HBV e submetidas ao pirosequenciamento das mutações de resistência do HBV. O RNA do HIV foi amplificado em treze amostras, que foram submetidas a análise da mutação M184V/I. O sequenciamento de Sanger da região genômica S do HBV foi realizado em 15 amostras e da região do motivo YMDD do HIV foi realizado em 2 amostras, para posterior comparação com os resultados do pirosequenciamento. A análise da mutação M204V/I foi realizada com sucesso em 23 amostras. A maioria das amostras (69,6%; 16/23) apresentou uma mistura de populações selvagens (M204) e mutantes (M204V/I). Apenas população mutante M204V foi encontrada em 21,7% (5/23) e 8,7% (2/23) das amostras estudadas eram compostas apenas por populações selvagens. A mutação V173L foi investigada em 20 amostras. Apenas populações selvagens foram encontradas em 90% (18/20) das amostras e apenas populações mutantes foram encontradas em 10% (2/20) das amostras. Nas amostras submetidas ao sequenciamento de Sanger o resultado foi o mesmo em ambos os métodos, com exceção das amostras que apresentaram população mista no pirosequenciamento, as quais o sequenciamento padrão detectou apenas as populações majoritárias. A mutação L180M foi investigada em 15 amostras e apenas cepas selvagens foram encontradas, pelo método de pirosequenciamento, no entanto, esse resultado foi desconsiderado devido a uma provável falha no oligonucleotídeo utilizado para essa mutação, uma vez que o sequenciamento de Sanger detectou 4 amostras com essa mutação. A mutação M184V/I do HIV foi investigada em 9 amostras, e apenas populações selvagens foram encontradas. O mesmo resultado foi confirmado pelo sequenciamento. O pirosequenciamento é uma técnica sensível que pode ser útil na detecção e quantificação de subpopulações de vírus resistentes, que talvez não fossem detectadas por outros métodos. Porém alguns ajustes ainda devem ser feitos para a detecção da mutação rtL180M, que foi encontrada nas amostras analisadas apenas pela técnica de Sanger. A alta sensibilidade do pirosequenciamento permite que se avalie a melhor conduta terapêutica para um paciente, pois é possível detectar a proporção de cepas selvagens e mutantes infectando o indivíduo, permitindo uma intervenção precoce durante o tratamento.