Desenvolvimento de protocolo de edição gênica de Enterococos resistentes à vancomicina (VRE) empregando CRISPR-Cas

• Autor(a) principal: Valente, Isabela Cardoso Côrrea Póvoa
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense (RIUFF)
• Texto Completo: http://app.uff.br/riuff/handle/1/29847
• topic: Enterococcus spp, resistência a antimicrobianos, reversão da resistência, CRISPR-Cas 9, edição gênica; Enterococcus, Resistencia a antibioticos, Vancomicina

Enterococos resistentes à vancomicina (VRE) são bactérias que apresentam resistência a diversos antimicrobianos e se tornaram uma preocupação nas últimas décadas em ambientes hospitalares. Recentemente, esse grupo de bactérias, que por muitos anos foram consideradas inofensivas para os seres humanos e sem importância médica, têm se tornado um dos patógenos nosocomiais mais comuns. A disseminação de VRE ocorre pela colonização do trato gastrointestinal dos pacientes e pela transmissão entre indivíduos. Diante desse cenário, a técnica CRISPR-Cas, um sistema imune adaptativo presente em bactérias e arqueias, tem despertado interesse como uma abordagem promissora no combate às infecções por VRE. A utilização da técnica CRISPR-Cas permite a clivagem de genes específicos, modificações genéticas ou indução de mutações que tornam as bactérias mais suscetíveis aos tratamentos antimicrobianos. Essa estratégia oferece novas perspectivas no tratamento de infecções por microorganismos. Assim, o presente estudo objetivou desenvolver um protocolo baseado no sistema CRISPR-Cas para edição gênica de cepas de VRE com a finalidade de analisar seu efeito na reversão de resistência à vancomicina. Neste estudo, foi utilizada a cepa de Enterococcus faecalis A256 (vanA positivo). A presença do gene vanA na cepa utilizada foi confirmada por meio da técnica de PCR. Diferentes parâmetros foram testados durante os ensaios, considerando a concentração inicial do inóculo da cepa teste e os pulsos elétricos durante a eletroporação. As cepas foram utilizadas na fase log do crescimento bacteriano e os inóculos foram preparados testadas com três densidades ópticas diferentes (0,6, 0,8 e 1,0), a fim de averiguar qual apresentaria um melhor resultado. Foi utilizado um crRNA específico previamente desenhado para o gene de resistência. Para a inativação do gene alvo, foi utilizado o sistema Alt-R® CRISPR-Cas9 e para formação do complexo RNP foi utilizado o sistema Alt-R® CRISPR-Cas9 RNP. A entrega do sistema de edição gênica nas células-alvo foi feita por eletroporação. Para a eletroporação, os pulsos elétricos foram programados para ocorrerem em três voltagens diferentes (1.500 kV/cm, 1.750 kV/cm e 2.000 kV/cm) com objetivo de verificar qual apresentaria melhor resultado. Após a eletroporação, a fim de averiguar a efetividade da edição gênica, foi adicionado meio de cultura Brain Heart Infusion ao inóculo e as amostras foram incubadas por 1 hora, após esse período foi realizado o semeio em ágar Mueller-Hinton e, posteriormente, empregou-se a técnica replica plating, sendo realizada a semeadura de em média 55 colônias por placa com ausência e presença de vancomicina, identificando cada colônia microbiana por sua posição na placa de cultura. Como resultado, observamos a reversão da resistência de em 12 de 170 colônias isoladas após a eletroporação. Todas as concentrações da cepa e pulsos elétricos avaliados geraram resultados similares. Com base nos objetivos propostos neste estudo, diante destes resultados, concluímos que foi possível utilizar com sucesso o sistema CRISPR-Cas para edição gênica em amostras de VRE, visando analisar o efeito na reversão da resistência à vancomicina e o protocolo baseado no sistema CRISPR-Cas desenvolvido foi eficiente em todos os parâmetros adotados. Análises adicionais são necessárias para confirmação da ausência/inativação do gene vanA.