Inoculação e detecção de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum em sementes de algodão (Gossypium hirsutum L.)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Barbosa, Juliana Franco
Data de Publicação: 2007
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFLA
Texto Completo: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/2786
Resumo: Fitopatologia
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spelling Inoculação e detecção de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum em sementes de algodão (Gossypium hirsutum L.)Inoculation and detection of Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum in cotton seeds (Gossypium hirsutum L.)SementesBactériasMancha angularAlgodãoBacterial blightSeedsCottonCNPQ_NÃO_INFORMADOFitopatologiaNo presente trabalho objetivou-se desenvolver uma técnica de inoculação artificial de sementes de algodão com Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam), por meio do condicionamento osmótico do meio, visando a obtenção de sementes uniformemente contaminadas, sem alterar o poder germinativo das mesmas, bem como estabelecer metodologia segura, eficiente e rápida de detecção da bactéria em sementes de algodão. Avaliou-se a variabilidade entre isolados de Xam por meio da inoculação artificial em plantas de algodão, hipersensibilidade em plantas de fumo, tomate e pimentão, amplificação do DNA utilizando-se os primers 16S e 23S, ERIC e REP; desenvolveu-se um meio de cultura semi-seletivo para a detecção de Xam em sementes de algodão e testou-se a eficiência da técnica de imunofluorescência indireta na detecção da bactéria, utilizando-se três tipos de extrato de sementes: bruto, centrifugado e filtrado em membrana de Millipore®. Por meio do condiconamento osmótico, verificou-se que não houve diferença estatística entre os solutos manitol e sacarose quanto à porcentagem de germinação de sementes e crescimento bacteriano, e que nos potenciais osmóticos de -0,85 e -1,0 MPa a inibição de germinação das sementes sobre o meio 523 foi mais eficiente. A inoculação por condicionamento osmótico foi eficiente e o tempo de 24 horas de exposição à bactéria permitiu obter sementes com 84,5% de incidência de Xam. Eletromicrografias, realizadas por microscopia de varredura, revelaram a presença de Xam associada à tegumento das sementes em todos os tempos de inoculação. A incidência da bactéria nas sementes, detectada pelo plaqueamento direto em meio semi-seletivo, foi maior no método de inoculação por condicionamento osmótico com 88% de sementes infectadas, não havendo diferença significativa entre os métodos de inoculação utilizados para a porcentagem de cotilédones com sintomas da mancha angular. Diferenças quanto a virulência dos isolados em algodão foram observadas, sendo constatados quatro grupos distintos entre si. Para a reação de hipersensibilidade, plantas de tomateiro foram as mais indicadas na identificação de isolados patogênicos de Xam. Os primers 16S e 23S permitiram obter fragmentos de aproximadamente 680 pb. A amplificação via PCR utilizando a unidade repetitiva REP, foi efetiva para todos os isolados de Xam. No entanto, o número de padrões de bandas em cada isolado foi significativamente menor quando comparado aos primers ERIC. Utilizando-se o meio 523 de Kado & Heskett (1970) como base, desenvolveu-se o seguinte meio seletivo: 30 g manitol, 4 g de extrato de levedura, 8 g de caseína hidrolizada, 2 g de K2HPO4, 0,3 g MgSO4.7H2O, 15 g agar, 1000 mL água destilada, após autoclavagem adicionar, 50 mg de cefalexina, 50 mg de cefadroxil, 10 mg de clorotalonil e 300 µL de triadimenol. Comparado aos meios de cultura semi-seletivos descritos por Metha et al., (2005) e Dezordi (2006), verificou-se que todos os meios utilizados foram eficientes na recuperação de Xam em sementes. Por meio da técnica de imunofluorescência indireta, foi possível verificar a presença de Xam em todos os extratos avaliados.The objectives in the present study were to develop a technique for artificial inoculation of cotton seeds with Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam), through the use of the osmotic conditioning technique, aiming to obtain uniformly contaminated/infected seeds, with preservation of the germination potential of the seeds, as well as to establish a safe, efficient and fast methodology for the detection of the bacterium in cotton seeds. The variability of isolates of Xam was assessed through the artificial inoculation of cotton plants, hypersensibility in tobacco, tomato and sweet pepper plants and amplification of DNA with the primers 16S and 23S, ERIC and REP. A semi-selective culture medium was developed for the detection of Xam in cotton seeds and the efficiency of the indirect immunofluorescence technique was tested in the detection of this bacterium. In the artificial inoculation with the osmotic conditioning technique it was verified that the solutes mannitol and sucrose had no statistical difference in relation to percentage of seed germination and bacterial growth. The osmotically modified 523 medium with potential of -0.85 and -1.0 MPa presented the strongest effect on the inhibition of seed germination. The inoculation through osmotic conditioning technique was efficient and the 24 hours seed exposition to the bacterial inoculum allowed the recovering of seeds with 84.5% incidence of that pathogen. Electromicrographs (taken in a Scanning Electron Microscope) revealed the presence of Xam associated with the seed peel in all the inoculation periods. The incidence of the bacterium in the seeds, detected by direct plating in semi-selective medium, was higher in the inoculation method that used osmotic conditioning, with level of 88% occurrence, with no statistical difference for the percentage of cotyledons with symptoms of bacterial blight amongst the inoculation methods used. Differences in virulence amongst the isolates in cotton were observed, with four distinct groups. In relation to HR reaction, the tomato plants were the most adequate host for the identification of the Xam pathogenic strains. The primers 16S and 23S amplified fragments of approximately 680 bp. The PCR amplification using the REP, repetitive unit, was effective to all Xam strains, however, the number of band patterns in each strain was significantly lower when compared with the ERIC oligonucleotides. Using the 523 medium of Kado and Heskett (1970) as the basal medium, the following selective medium was developed: 30 g of mannitol, 4 g of yeast extract, 8 g of hydrolyzed casein, 2 g of K2HPO4, 0.3 g of MgSO4.7H2O, 15 g of agar, 1000 mL of distilled water, with addition of 50 mg of cefalexin, 50 mg of cefadroxil, 10 mg of chlorathalonil and 300 µL of triadimenol after autoclaving. This medium and the semi-selective culture medium of Metha et al., (2005) and Dezordi (2006), were all effective in recovering of Xam from the seeds. The efficiency of the indirect immunofluorescence technique also was tested by using three types of seed extracts (crude, centrifuged and filtered in Millipore® membrane), with the observation of the bacterium in all extracts when using this technique.UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRASDFP - Programa de Pós-graduaçãoUFLABRASILSouza, Ricardo Magela deMachado, José da CruzBeriam, Luís Otávio SaggionVon Pinho, Édila Vilela de ResendeFigueira, Antonia dos ReisBarbosa, Juliana Franco2014-08-14T17:52:09Z2014-08-14T17:52:09Z2014-08-142007-08-08info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfBARBOSA, J. F. Inoculação e detecção de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum em sementes de algodão (Gossypium hirsutum L.). 2007. 135 p. Tese (Doutorado em Agronomia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2007.http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/2786info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFLAinstname:Universidade Federal de Lavras (UFLA)instacron:UFLA2014-08-25T18:38:02Zoai:localhost:1/2786Repositório InstitucionalPUBhttp://repositorio.ufla.br/oai/requestnivaldo@ufla.br || repositorio.biblioteca@ufla.bropendoar:2014-08-25T18:38:02Repositório Institucional da UFLA - Universidade Federal de Lavras (UFLA)false
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