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Monica Cristina de Oliveirahttp://lattes.cnpq.br/0383215992450256Diego dos Santos FerreiraGisele Assis CastroElton Luiz Silvahttp://lattes.cnpq.br/3326622246355582Fernanda Alves Boratto2020-07-16T16:50:23Z2020-07-16T16:50:23Z2016-02-19http://hdl.handle.net/1843/33810O câncer de mama é o tipo de câncer que mais acomete mulheres em todo o mundo, tanto em países em desenvolvimento quanto em países desenvolvidos, sendo responsável por 20% dos casos novos de câncer a cada ano. As antraciclinas, particularmente a doxorrubicina, desempenham um papel importante no tratamento do câncer de mama. Entretanto, a elevada toxicidade, principalmente a cardiotoxicidade, e a baixa penetração em tumores sólidos são as principais causas de sua limitação como agente terapêutico. A encapsulação da doxorrubicina em lipossomas de circulação prolongada demonstrou benefícios, como a redução na incidência de efeitos adversos, dentre eles a toxicidade cardíaca, culminando no desenvolvimento da primeira formulação lipossomal para o tratamento do câncer, o Doxil®, aprovado pelo FDA desde 1995. Apesar das vantagens, os lipossomas de circulação prolongada apresentam uma baixa taxa de liberação do fármaco encapsulado e/ou dificuldade para fundir com a membrana endossomal após a internalização celular. Esses fatores reduzem a concentração intracitoplasmática do fármaco, o que pode comprometer a eficácia terapêutica. Diante disso, formulações lipossomais pH-sensíveis contendo agentes antitumorais têm sido desenvolvidas para explorar a acidificação endossomal, que leva à desestabilização das membranas lipossomais seguida da liberação de seu conteúdo no meio intracitoplasmático. No presente trabalho, foram desenvolvidos e caracterizados lipossomas pH-sensíveis de circulação prolongada contendo doxorrubicina (SpHL-DXR) para avaliação da atividade citotóxica contra a linhagem de câncer de mama murino 4T1, assim como a atividade antitumoral em um modelo de tumor xenográfico mamário em camundongos. A formulação foi caracterizada fisico-quimicamente por análises de diâmetro médio, índice de polidispersão (IP), potencial zeta e teor de encapsulação. Foram obtidos valores de diâmetro médio inferior a 200 nm, IP menor que 0,2 e potencial zeta próximo a neutralidade, permitindo a aplicação dessa formulação para os estudos in vivo. Estudo de estabilidade de armazenamento dos lipossomas brancos (isentos de doxorrubicina) a 4°C comprovou a manutenção das características físico-químicas da formulação por até seis meses, sugerindo a possibilidade da produção de um kit contendo, separadamente, a formulação branca e a doxorrubicina liofilizada, para aplicação em uso clínico. Os estudos de pH-sensibilidade demonstraram responsividade dos lipossomas a alterações de pH. A citotoxicidade dos SpHL-DXR contra células da linhagem 4T1 foi avaliada por meio do ensaio de metabolização do MTT. O valor de IC50 obtido após o tratamento com SpHL-DXR foi igual a 1563 nM. Esse valor corresponde a uma redução de 35% em relação ao tratamento com a DXR livre (IC50 igual a 2413 nM), indicando melhora da citotoxicidade da DXR quando encapsulada nessa formulação. Para o estudo de atividade antitumoral, camundongos portadores de tumor xenográfico mamário foram tratados com tampão HEPES-salina pH 7,4 (grupo controle), lipossomas pH-sensíveis de circulação prolongada isentos de doxorrubicina (SpHL brancos), solução de doxorrubicina, formulação lipossomal semelhante ao Doxil® ou SpHL-DXR (dose igual a 4 mg de doxorrubicina.Kg-1) por via endovenosa a cada dois dias, totalizando quatro administrações. Os seguintes parâmetros foram avaliados durante o período de tratamento: volume tumoral e suas características histológicas, peso corporal, peso do tumor e avaliação histológica de órgãos de interesse (fígado, baço, rim, pulmão, osso e coração). Em termos do volume tumoral, o tratamento com SpHL-DXR foi capaz de estabilizar o crescimento tumoral, ao contrário do tratamento com solução de doxorrubicina. Quanto a avaliação histológica, foram observadas maiores áreas de necrose, com células em cariólise e cariorrexe, nos tumores tratados com SpHL-DXR, enquanto os demais grupos apresentaram áreas de necrose menos extensas e maiores áreas compostas por células viáveis. Os órgãos analisados histologicamente (fígado, baço, pulmão, rim, osso e coração) do grupo tratado com SpHL-DXR não apresentaram alterações na arquitetura celular, indicando ausência de toxicidade.Breast cancer is the most common cancer in women worldwide, with 20% of all new cases of cancer each year, both in developing or developed countries. Anthracyclines, especially doxorubicin, play an important role in the treatment of breast cancer, however, the high toxicity, especially cardiotoxicity, and low penetration in solid tumors are the main limitations for its use. The encapsulation of doxorubicin in long-circulating liposomes helped to reduce the incidence of adverse effects, including cardiac toxicity, which led to the approval by FDA in 1995 of the first liposomal formulation for cancer treatment, Doxil®. Despite its advantages, generally long-circulating liposomes exhibit a low drug release rate and tend not to be able to merge with the endosomal membrane upon cell internalization. These factors reduce the intracytoplasmic concentration of the drug, which can compromise the therapeutic efficacy. Therefore, pH-sensitive liposomal formulations containing anticancer drugs have been developed to take advantage of the endosomal acidification, which leads to destabilization of the liposomal membranes followed by intracytoplasmic release of its internal content. In this work, it was developed a long-circulating and pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin (SpHL-DXR) for evaluation of cytotoxicity against the murine breast tumor cell line 4T1 and the antitumor activity in a breast cancer animal model. SpHL-DXR were characterized by average diameter, polydispersity index (IP), zeta potential and encapsulation efficacy analyses. The average diameter was below 200 nm with IP no higher than 0.2 and zeta potential close to neutrality, allowing the application of this formulation for in vivo studies. Storage stability evaluation of blank liposomes (without doxorubicin) at 4°C confirmed the maintenance of the physico-chemical characteristics for up to six months, suggesting the possibility of production of a kit containing, separately, the blank formulation and the lyophilized doxorubicin for administration in patients. pH-sensitivity studies have shown responsiveness of liposomes to pH variations. Cytotoxicity of SpHL-DXR against 4T1 cell line was evaluated by MTT assay. IC50 obtained for SpHL-DXR treatment was equal to 1563 nM. This value corresponds to 35% reduction when compared to free DXR (IC50 equal to 2413 nM), indicating a strong improvement of cytotoxic activity upon liposomal encapsulation. For antitumor activity studies, breast tumor-bearing mice were intravenously treated with HEPES-buffered saline pH 7.4 (control group), blank liposomes, free doxorubicin, liposomal formulation similar to Doxil® or SpHL-DXR (dose equal to 4 mg of doxorrubicin.Kg-1) every two days, in a total of four administrations. The following parameters were evaluated during the treatment period: tumor volume, tumor weight, and animal’s body weight. Histological examination of tumor and organs of interest (liver, spleen, kidney, lung, bone and heart) were performed. Considering the tumor volume analyses, SpHL-DXR were able to stabilize tumor growth in contrast to free doxorubicin. For tumor histological analyses, it were observed large areas of necrosis with cell karyolysis and karyorrhexis in tumors treated with SpHL-DXR, while for the other groups less extensive areas of necrosis and larger areas of viable cells were observed. The histological analyses of organs (liver, spleen, lung, kidney, bone and heart) of animals treated with SpHL-DXR showed no alterations in cell architecture, suggesting lack of toxicity.FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas GeraisporUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasUFMGBrasilFARMACIA - FACULDADE DE FARMACIADoxorrubicinaLipossomas pH-sensíveisCâncer de mamaAtividade antitumoralInvestigação da atividade antitumoral de lipossomas pH-sensíveis de circulação prolongada contendo doxorrubicina em modelo animal experimentalInvestigation of antitumor activity of long-circulating pH-sensitive liposomes containing doxorubicin in an experimental animal modelinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALDISSERTAÇÃO VERSÃO FINAL 150120.pdfDISSERTAÇÃO VERSÃO FINAL 150120.pdfapplication/pdf2665970https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/33810/3/DISSERTA%c3%87%c3%83O%20VERS%c3%83O%20FINAL%20150120.pdf7c0e78d6980892204fa09adba641fe44MD53LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82119https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/33810/4/license.txt34badce4be7e31e3adb4575ae96af679MD541843/338102020-07-16 13:50:23.987oai:repositorio.ufmg.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2020-07-16T16:50:23Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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