Prospecção dos inibidores de fosfolipases A2 das classes alfa e gama (PLI e PLI) endógenos no plasma de serpentes Crotalidae brasileiras: caracterização molecular e propriedades biológicas

• Autor(a) principal: Maria Inacia Estevao Costa
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8U4J5R
• topic: Bioquímica e imunologia; Bioquímica; Serpentes; Fosfolipase A2 Inibidores; Cobra Veneno; Inibidores enzimáticos

A presença de inibidores plasmáticos de fosfolipase A2 (PLA2) no plasma de serpentes tem sido relatada por vários pesquisadores. Estes inibidores atualmente são classificados em três classes: alfa, beta e gama, de acordo com sua estrutura (Ohkura e cols., 1997). Inibidores alfa apresentam domínios semelhantes ao domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) das lectinas tipo-C, enquanto inibidores da classe gama apresentam em sua estrutura, repetições ricas em leucina (LRR), como a 2-macroglobulna humana. Já a classe gama mostram um padrão de resíduos cisteína similar ao do receptor do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (u-PAR). Neste trabalho investigamos a presença de cDNAs codificadores de inibidores de PLA2 (PLIs) das classes alfa e gama no fígado de seis espécies de serpentes do gênero Bothrops (B. alternatus, B. erythromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi), além de Lachesis muta muta e Crotalus durissus terrificus. Os cDNAs foram obtidos por RT-PCR a partir do RNA total do fígado de cada espécime. A amplificação do DNA foi realizada por PCR na presença de oligonucleotídeos desenhados com base na sequência de nucleotídeos publicados na literatura (inibidor alfa de Agkistrodon blomhoffii siniticus e no inibidor gama de C. d. terrificus). Os produtos de amplificação foram clonados em vetores do tipo TA e colônias recombinantes positivas foram confirmadas por PCR. Os DNAs de pelo menos quatro clones positivos para cada inibidor alfa e dois clones para cada inibidor gama foram completamente sequenciados. As sequências nucleotídicas, assim como as estruturas primárias deduzidas foram alinhados com sequências de inibidores conhecidos para pesquisa de homologia. Utilizando ferramentas de bioinformática foram realizadas análises detalhadas para cada proteína. Foram derivadas árvores filogenéticas para cada classe de PLIs brasileiros descritos, assim como a sugestão de modelos tridimensionais. A expressão de uma proteína recombinante da classe alfa foi realizada com sucesso em sistema de expressão procariota.