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Carlos Delfin Chavez OlorteguiAdriano Monteiro de Castro PimentaMarcelo Matos SantoroPaula Henriques Cruz Ciscotto2019-08-11T02:10:58Z2019-08-11T02:10:58Z2011-08-09http://hdl.handle.net/1843/BUOS-B9JFX2Com o desenvolvimento tecnológico, áreas da pesquisa como a proteômica, análises anti-venômicas e prospecção de novas proteínas com atividade biológica em venenenos de serpentes vem crescendo nos últimos anos. Estudos de venenos raros e de difícil obtenção, como os venenos de serpentes do gênero Micrurus começaram a ser realizados com maior frequencia. O gênero Micrurus (cobra coral) é o principal representante da família Elapidae nas Américas e compreende 61 espécies distribuídas do Sul dos Estados Unidos ao sul da América do Sul. No envenenamento por espécies deste gênero são observados sintomas neurotóxicos devidos a um progressivo bloqueio da transmissão neuromuscular, o que pode levar a vítima à morte por paralisia muscular e parada respiratória. Apesar da sua alta toxicidade poucas informações existem acerca da caracterização bioquímica e farmacológica desse veneno. No presente trabalho, em um primeiro momento, análises proteômicas foram realizadas objetivando o melhor entendimento da composição dos venenos das espécies M. frontalis, M. ibiboboca e M. lemniscatus. Nos três venenos investigados, proteínas com massa moleculares entre 6 e 8 kDa e 12 e 14 kDa mostraram-se mais abundantes. Por meio de sequenciamento Nterminal de proteinas purificadas, seqüenciamento por espectrometria de massa (MS/MS) de peptídeos trípticos de eletroforese bidimensional e pesquisa de similaridade em bancos de dados, foi verificado que os venenos são compostos de proteínas similares à: neurotoxinas de cadeia curta e de cadeia longa, weak neurotoxinas, venom protein E2, frontoxina III, precursores de lectina tipo C, PLA2, LAO, metaloproteases e â-bungarotoxina. Ainda, forma relatados pela primeira vez, a sequência N-terminal de sete proteínas purificadas do veneno de M. lemniscatus, similares à 3FTx, PLA2 e inibidores de proteases do tipo-kunitz já descritas em venenos de outras Micrurus e Elapídeos. Em um segundo momento, a atividade anti-venômica foi investigada por meio da reação cruzada entre diferentes venenos de Micrurus e antivenenos mono e polivalente, por meio de eletroforese bidimensional e immunoblotting. O antiveneno polivalente anti-Elapídico apresentou maior grau de reatividade cruzada com os venenos de M. frontalis, M. ibiboboca, M. lemniscatus e de espécimes peruanos de M. spixii, sendo este último usado como um ponto externo, exemplificando um veneno que não é comumente encontrado no Brasil. Ainda, o anti M. corallinus reagiu fracamente com as proteínas dos venenos testados, tendo o anti-M. ibiboboca mostrado melhor reação quando comparado ao anti-M.corallinus. As proteínas mais imunogências dos venenos pertencem são similares a 3FTx, PLA2, âbungarotoxin, venom protein E2, frontoxina III, LAO e proteínas tipo lectina tipo C. As implicações destes resultados para a produção de antivenenos contra Micrurus são discutidas. Ainda, como terceiro passo de investigação, duas proteínas da família das 3FTx, com massas moleculares de 6435,4 Da e 6504,6 Da foram purificadas à partir do veneno de M. lemniscatus e tiveram sua toxicidade ensaiada contra células de parasitas e de mamíferos. Ambas as proteínas foram tóxicas para formas promastigotas de L. (L). amazonensis, apresentando uma porcentagem de morte de 49% e 39% dos protozoários, respectivamente, na concentração de 50 µg/mL. Entretanto, as mesmas proteínas mostraram-se tóxicas para macrófagos isolados de camundongos.Coral snakes from Micrurus genus are the main representatives of the Elapidae family in South America. However, biochemical and pharmacological features of the constituents of their venoms remain poorly investigated. In this study, venomic analyses were carried out aiming a deeper understanding of the composition of the venoms of M. frontalis, M. ibiboboca, and M. lemniscatus. To achieve this goal, two-dimensional chromatography and mass spectrometry analyses, together with N-terminal sequencing were employed. In these three observed venoms, proteins with masses ranging from 6 to 8 kDa and 12 to 14 kDa, related to 3FTx and PLA2 protein families, respectively, were found to be the most abundant. We also report, for the first time, the N-terminal sequence of four new proteins purified from the M. lemniscatus venom that are similar to 3FTx, PLA2 and Kunitz-type protease inhibitor from other Micrurus and elapid venoms. Moreover, cross-reactivity among different Micrurus venoms and antivenoms (anti-M. corallinus, anti-M. frontalis, anti-M. ibiboboca and anti-Elapidic) was carried out by means of 2D-electrophoresis and immunoblotting assays. The generic anti-Elapid venom displayed the highest degree of cross-reactivity. Conversely, anti-M. corallinus reacted weakly against M. frontalis, M. lemniscatus, M. ibiboboca and M. spixii venoms. In gel digestions, followed by mass spectrometry analyses and databank similarity searching, revealed the most immunogenic protein families as similar to short and long neurotoxins, weak neurotoxins, PLA2, -bungarotoxin, venom protein E2, frontoxin III, L-amino acid oxidase and C-type lectin. The implications of our results for the production of Micrurus antivenoms are discussed. Additionaly, two proteins from 3FTx family, with molecular masses of 6435,4 Da and 6504,6 Da, were purified from the venom of M. Lemniscatus. Their toxicity against Leishmania and mammals cells was tested. Both proteins were toxic to promastigotic forms of the L. (L). amazonensis, leading to 49% and 39%, respectively, of death on the protozoan population in the 50 µg/mL concentration. However, both proteins were also toxic to mice macrophages.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGVenenos de SerpentesAntivenenoBioquímica e imunologiaProteômicaBioquímicaAnálises proteômicas, anti-venômicas e isolamento de novas proteínas com atividade citotóxicas de venenos elapídicosinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALtese_doutorado_paula_ciscotto_final.pdfapplication/pdf4571922https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-B9JFX2/1/tese_doutorado_paula_ciscotto_final.pdf996f5e705829b258659dcf1c8b64a6acMD51TEXTtese_doutorado_paula_ciscotto_final.pdf.txttese_doutorado_paula_ciscotto_final.pdf.txtExtracted texttext/plain347596https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-B9JFX2/2/tese_doutorado_paula_ciscotto_final.pdf.txt3418832f8d417aa41262e3f16575b1bcMD521843/BUOS-B9JFX22019-11-14 04:20:14.708oai:repositorio.ufmg.br:1843/BUOS-B9JFX2Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T07:20:14Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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