Estudo do papel das proteínas MSH2 e MSH6 na resposta a danos no DNA em Trypanosoma cruzi

• Autor(a) principal: Viviane Grazielle da Silva
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/42837
• topic: Trypanosoma cruzi; Doença de chagas; MMR; DNA; Bioquímica e imunologia; Trypanosoma cruzi; Doença de Chagas; Reparo de Erro de Pareamento de DNA

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, apresenta uma estrutura populacional altamente heterogênea, caracterizada pela ocorrência de diferentes cepas com características morfológicas e bioquímicas distintas. Essa estrutura populacional complexa pode estar relacionada às diferentes manifestações clínicas da doença, à capacidade do parasito de infectar diferentes hospedeiros e à distribuição geográfica apresentada pelas cepas. A variabilidade intra-específica é resultante de um balanço entre a manutenção da estabilidade genômica e a geração de variabilidade genética. Diversos mecanismos estão envolvidos na manutenção deste equilíbrio, entre eles, o sistema de reparo de DNA por erros de pareamento ou MMR. Estudos iniciais sobre o MMR em T. cruzi levaram à descoberta de que o MSH2 – a principal proteína do MMR – existe em três isoformas diferentes no parasita, denominadas TcMSH2 A, B e C, de acordo com os dados de seqüências de Tcmsh2 presente no genoma de diferentes cepas. Evidencias experimentais indicam que cepas apresentando a isoforma TcMSH2 A apresentam um MMR mais eficiente quando comparadas a cepas que possuem as isoformas TcMSH2 B e/ou C. Essas observações nos levaram a especular que as diferenças na atividade do MMR poderiam ser responsáveis pela menor variabilidade genética encontrada em cepas pertencentes aos haplogrupos de MSH2-A. Com o objetivo de investigar o papel da proteína MSH2, foi planejada a obtenção de parasitas nocautes para este gene. Análises dos parasitas heminocautes de Tcmsh2 demonstraram que, apesar destes não apresentarem diferenças frente ao tratamento com agentes mutagênicos, estes são mais susceptíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio e acumulam mais 8-oxoguanina no DNA mitocondrial do que parasitas selvagens. Para verificar o papel de TcMSH2 na resposta ao estresse oxidativo, no presente trabalho foram feitos experimentos buscando elucidar a localização da proteína no parasita. Para tal, anticorpos produzidos em camundongos contra uma forma recombinante de TcMSH2 foram utilizados em ensaios de imunolocalização e western blot. Esses experimentos mostraram que os soros produzidos reconhecem proteínas nativas de T. cruzi apresentando massas moleculares diferentes, e ainda que essas proteínas apresentam localização subcelular distintas. Isso nos levou a propor que a forma de menor massa molecular, localizada em extrato protéico correspondente à fração citoplasmática, estaria envolvida no reparo do DNA mitocondrial. Paralelamente, para avaliar se o papel de TcMSH2 na resposta a danos oxidativos dependia de outras proteínas da via de MMR, iniciamos a caracterização das mesmas. Para tal, foram geradas construções para deleção do gene Tcmsh6. Como estratégia adicional, a fim de elucidar o papel de TcMSH6, demos início, também, a experimentos tentando determinar a sua localização subcelular, através da sua expressão em fusão com RFP.