Duplo papel da proteína MSH2 no reparo de erros de pareamento no DNA e na resposta ao estresse oxidativo em tripanosomatídeos

• Autor(a) principal: Viviane Grazielle da Silva
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/35469
• topic: Bioquímica; Imunologia; Proteína 2 homóloga a MutS; Reparo de erro de pareamento de DNA; Estresse oxidativo; Trypanosoma cruzi; Trypanosoma brucei brucei

Diversos mecanismos estão envolvidos na manutenção da integridade genômica de qualquer organismo, entre eles o Sistema de Reparo de Erros de Pareamento (MMR). Responsável principalmente pelo reconhecimento de erros de pareamento e alças de inserção e deleção que podem ocorrer após a replicação do DNA, o principal componente do MMR é formado pelas proteínas MutS e MutL encontradas em procariotos e diversas proteínas MSH e MLH presentes em eucariotos. Estudos anteriores voltados para a caracterização da via de MMR nos tripanosomatídeos Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei revelaram dados sugerindo o envolvimento dessas proteínas também na resposta aos danos oxidativos no DNA. Em T. cruzi a análise da sequência da proteína MSH2 em diferentes cepas do parasito mostrou a existência de três diferentes isoformas da proteína na população do parasito. Para investigar o papel dessa proteína, foram produzidas linhagens de epimastigotas de T. cruzi nas quais um ou ambos os alelos do gene msh2 foram deletados. Uma vez que clones contendo a deleção de um dos alelos mostraram-se mais susceptíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2), foi sugerido o envolvimento dessa proteína na resposta ao dano oxidativo no DNA. Resultado semelhante foi observado para clones nocautes de msh2 em T. brucei: formas sanguíneas nas quais um ou ambos alelos de msh2 foram deletados mostraram-se mais susceptíveis ao tratamento com H2O2 quando comparados aos parasitos selvagem. Por outro lado, surpreendentemente, linhagens de epimastigotas de T. cruzi contendo a deleção dos dois alelos de msh2, assim como as linhagens nocaute de msh2 geradas nas formas procíclicas de T. brucei, apresentaram maior resistência ao tratamento com H2O2 quando comparados aos parasitos selvagens. No T. cruzi a deleção dos dois alelos do gene msh2 resultou também em uma maior capacidade de sobrevivência no interior de macrófagos, uma célula capaz de gerar altos níveis de espécies reativas de oxigênio. Com a finalidade de avaliar se a proteína MSH2 estaria envolvida na resposta ao estresse oxidativo de uma maneira independente de outras proteínas do MMR foram gerados clones de T. cruzi msh6 heminocautes, os quais apresentaram também uma maior susceptibilidade ao estresse oxidativo. A localização nuclear das duas proteínas MSH2 e MSH6 foi obtida por meio da análise de microscopia de fluorescência dessas proteínas em fusão com tag de c-myc e HA ou RFP em parasitos transfectados. Proteínas capazes de interagir com o MSH2 foram investigadas por meio da geração de parasitos nos quais a proteína TbMSH6 foi expressa com um tag de HA e a proteína MSH2 expressa com um tag de myc. Ensaios de coimunoprecipitação com esses parasitos mostraram que a proteína MSH2 de T. brucei interage com MSH3 e MSH6, como esperado, porém não revelaram nenhuma interação adicional com outras proteínas mesmo após tratamento com agentes genotóxicos como o MNNG e H2O2. Tomados em conjunto, os nossos dados nos levaram a formular a hipótese de que a deleção dos dois alelos de msh2 nas formas epimastigotas de T. cruzi e nas formas procíclicas de T. brucei teriam maior impacto sobre a capacidade desses parasitos de resistir ao estresse oxidativo gerado pelo metabolismo essencialmente aeróbico dessas formas, as quais estão presentes nos vetores invertebrados desses parasitos. As diferenças no fenótipo dos mutantes de msh2 observadas nas formas sanguíneas do T. brucei, poderiam ser explicadas pelas diferenças no metabolismo dessas formas, o qual, em contraste com as formas procíclicas, é anaeróbico e gera, portanto, menos ROS. A hipótese de que os mutantes de msh2 na forma procíclica tenham que se adaptar para sobreviver na ausência de MSH2 foi corroborada pela análise comparativa da expressão gênica global que mostrou a diminuição nos níveis da enzima Fumarato Redutase NADH-dependente, envolvida na geração de ROS em linhagens msh2 nocaute de T. brucei.