Edição de genoma em Trypanosoma utilizando nucleases dedo de zinco e o sistema CRISPR/Cas9

• Autor(a) principal: Gabriela de Assis Burle Caldas
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/34934
• topic: Bioquímica; Imunologia; Genoma; Trypanosoma; Dedos de zinco; Sistemas CRISPR-Cas; Trypanosoma cruzi; Trypanosoma brucei brucei

A manipulação genética em tripanosomatídeos é uma ferramenta essencial para estudo desses organismos, muitos deles, agentes causadores de importantes doenças humanas e veterinárias. A introdução de DNA exógeno no genoma das células ou o nocaute de um gene requer um evento de quebra na dupla fita (do inglês, double strand break, ou DSB) e reparo dessa DSB por recombinação homóloga (HR) ou por outros mecanismos. Duas metodologias descritas recentemente em outros organismos foram testadas com objetivo de aumentar a eficiência de manipulação genética em T. cruzi e em T. brucei: a expressão de nucleases dedo de zinco (ZFNs) e o sistema CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats Cas9 associated). ZFNs são proteínas sintéticas que possuem a capacidade de se ligar de forma específica a uma sequência de DNA e causar DSB em uma região pré-definida no genoma. CRISPR/Cas9 faz parte do sistema de defesa de bactérias e archae contra invasão por vírus e plasmídeos envolvendo uma nuclease (Cas9) capaz de clivar uma sequência específica na presença de um pequeno RNA (do inglês, single guide RNA, ou sgRNA) que reconhece a sequência alvo por complementaridade. Nesse trabalho foi também testado o sistema de transfecção denominado nucleofection que resultou em uma eficiência 20 vezes maior em comparação com o protocolo de eletroporação convencional. Para testar a utilização de ZFNs, formas epimastigotas de T. cruzi e formas sanguíneas de T. brucei expressando enhanced GFP (eGFP) foram transfectadas com plasmídeos codificando o par de ZFNs desenvolvidas para reconhecer e clivar uma sequencia de egfp. Como não foi observada a perda da fluorescência verde nos parasitos e como também não foi possível detectar a expressão das ZFNs por western blot ou northern blot, concluímos que a expressão constitutiva dessas ZFNs direcionadas para sequências de egfp poderia ser tóxica para os parasitos. A expressão de ZFNs sob o controle da tetraciclina em T. brucei confirmou que essa proteína, apesar de afetar o crescimento, foi capaz de aumentar a eficiência de transfecção em até 15 vezes. Como para o T. cruzi não há um sistema adequado de expressão regulada por tetraciclina, foram geradas linhagens expressando a T7 RNA polimerase e o repressor da tetraciclina, as quais foram testadas após transfecção com um plasmídeo contendo o gene repórter de luciferase de renilla (Rluc) sob o controle do operador da tetraciclina. Entretanto, devido aos baixos níveis de expressão do repressor da tetraciclina, níveis elevados de Rluc foram obtidos mesmo antes da adição de tetraciclina. Ainda com o objetivo de testar as ZFNs, foi selecionado o gene de gp72 como alvo de um segundo par de ZFNs, pois o nocaute desse gene resulta em um fenótipo facilmente detectável de descolamento do flagelo do corpo do parasito. Diferente das ZFNs que tem egfp como alvo, a transfecção de parasitos expressando constitutivamente ZFNs direcionadas para gp72 com uma sequência contendo o gene de resistência a neomicina flanqueada por sequências de gp72, resultou em uma população resistente a G418 na qual 90% das células apresentaram o fenótipo de nocaute de gp72. Análises de PCR mostraram a inserção do gene de resistência no locus de gp72. Resultados similares foram obtidos com a transfecção de formas epimastigotas expressando constitutivamente Cas9 nuclease. Para testar o nocaute do gene de gp72 utilizando o sistema de CRISPR/Cas9, essa linhagem foi transfectada com um plasmídeo contendo sequências do sgRNA complementares a gp72 e transcritas pelo promotor de rRNA do T. cruzi. A análise dos parasitos após transfecção transiente com o plasmideo contendo o sgRNA resultou em uma população na qual aprox. 1% das células apresentaram o fenótipo nocaute de gp72. Em conjunto, nossos resultados mostraram que a utilização de ambos os tipos de nucleases resulta em um aumento expressivo na eficiência dos protocolos para nocaute gênico em T. cruzi, o que representa um enorme avanço para os estudos sobre esse parasito.