Caracterização funcional e estrutural da ribonuclease RRP44 de Trypanosoma brucei

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cesaro, Giovanna
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/55171
Resumo: Orientadora : Prof(a). Dra. Beatriz Gomes Guimaraes
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spelling Carneiro, Flávia Raquel GonçalvesUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Guimarães, Beatriz GomesCesaro, Giovanna2023-01-26T20:29:49Z2023-01-26T20:29:49Z2018https://hdl.handle.net/1884/55171Orientadora : Prof(a). Dra. Beatriz Gomes GuimaraesCoorientadora : Dra. Flávia Raquel Gonçalves CarneiroDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 29/03/2018Inclui referênciasResumo: Os tripanossomatídeos, grupo de protozoários ao qual pertencem os agentes causadores de várias doenças em humanos, como a doença do sono e a doença de Chagas, apresentam muitas diferenças ao nível molecular em relação aos demais eucariotos. No que diz respeito à estrutura dos ribossomos, enquanto nos demais eucariotos a subunidade 60S é formada por três moléculas de RNA (5S, 5.8S e 25S/28S), em tripanossomatídeos a subunidade 60S contém oito RNAs. Isto porque nestes organismos a molécula correspondente ao RNA de 25S/28S é dividida em seis segmentos. Tais diferenças estruturais indicam diferenças no processo de maturação do RNA ribossomal (rRNA), que resulta na excisão de sete sequências espaçadoras internas do precursor do rRNA. Entretanto, poucas endo e exonucleases envolvidas no processo de maturação do rRNA em tripanossomatídeos foram identificadas e caracterizadas. O exossomo é um complexo proteico formado por 11 proteínas, responsável pela degradação e processamento de diversos tipos de RNA, entre eles os rRNA. Das onze proteínas, apenas duas apresentam atividade catalítica, a RRP44 e RRP6. A RRP44 é uma proteína que apresenta atividade endo e exonucleolítica, e está envolvida, entre outros processos, na maturação do rRNA. O projeto tem como objetivo caracterizar funcionalmente e estruturalmente a proteína RRP44 de Trypanosoma brucei. A proteína e duas variantes contendo os sítios ativos endo e exonucleolítico (TbRRP44_NPIN e TbRRP44_CSD1-S1, respectivamente) foram expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia. A estrutura cristalográfica de TbRRP44_NPIN foi determinada a 2,3 Å de resolução e permitiu a análise de seu sítio catalítico e comparação com a estrutura da proteína homóloga de Saccharomyces cerevisiae. Tal comparação revelou diferenças na região do sítio ativo, com a identificação de um segundo domínio de ligação a zinco, bem como diferenças estruturais que podem indicar as bases moleculares para a não associação, em tripanossomatídeos, da proteína RRP44 ao complexo exossomo. Para a análise funcional foram produzidas células knockdown de T. brucei para a RRP44, através do mecanismo de RNA de interferência. A análise da taxa de proliferação celular mostrou que a proteína TbRRP44 é essencial para sobrevivência do parasita. Análises da integridade e abundância das subunidades 40S, 60S, 80S e polissomos através de sedimentação em gradiente de sacarose mostraram alterações significativas no perfil das subunidades nas células deficientes em RRP44, indicando um efeito de sua depleção na formação dos ribossomos. Além disso, a análise do processamento do pré-RNA ribossomal através de qPCR indica que a TbRRP4 atua na etapa inicial da maturação do precursor da subunidade maior (LSU), provavelmente na separação do precursor do 5.8S dos demais precursores da LSU. Palavras-chave: Trypanosoma brucei; maturação do rRNA; ribonuclease; RRP44; estrutura cristalográfica.Abstract: Trypanosomatids form a group of protozoan, which includes the causative agents of a number of serious diseases in humans, such as the sleeping sickness and Chagas disease. These parasites present unique features compared with other eukaryotes, for instance, Trypanosoma ribosomes contain specific RNA expansions and the 60S subunit is composed of eight RNA molecules instead of the three (5S, 5.8S and 25S/28S) found in other eukaryotes. The molecule corresponding to the rRNA 25S/28S is divided in six segments. These structural differences indicate differences in the ribosomal RNA (rRNA) maturation process, which results in the excision of seven internal spacers from the rRNA precursor. However the role of specific endo and exonucleases involved in Trypanosomatids rRNA maturation remains largely unknown. The exosome is a complex formed by eleven proteins and involved in several pathways related to RNA processing and degradation, including rRNA processing. Among the eleven subunits of the complex, two proteins present catalytic activity, Rrp44 and Rrp6. Rrp44 presents endo and exonuclease activities, and has been related to a specific step of the rRNA maturation. The objective of the project is to perform structural and functional characterization of RRP44 from Trypanossoma brucei. Full-length TbRRP44 and two variants including the endo and the exonuclease domains (TbRRP44_NPIN e TbRRP44_CSD1-S1, respectively) were overexpressed in Escherichia coli and purified by chromatographic methods. The crystal structure of the TbRRP44_NPIN was determined at 2.3 Å resolution and allowed the detailed analysis of the catalytic site and the structural comparison with the orthologue from Saccharomyces cerevisiae. The structural analysis revealed a specific metal biding site in the neighborhood of the catalytic site and additional structural differences that could explain the lack of interaction of RRP44 with the exosome complex, previously reported in Trypanosomatids. T. brucei knockdown cells for RRP44 were generated using RNA interference (RNAi) to perform phenotypic characterization. Proliferation curves confirmed that RRP44 is essential for the parasite survival. Moreover, analysis of 40S, 60S, 80S subunits and polysomes by sucrose gradient sedimentation showed remarkable differences between knockdown and control cells and analysis of the pre-rRNA processing intermediates by qPCR suggest that TbRRP44 has a role in the initial step of the ribosome large subunit (LSU) maturation, probably in the separation of the 7S from the other rRNA LSU intermediates. Key-words: Trypanosoma brucei; rRNA processing; ribonuclease; RRP44; Crystallographic structure.1 recurso online : PDF.application/pdfTrypanosoma bruceiBioquímicaRibonucleasesCaracterização funcional e estrutural da ribonuclease RRP44 de Trypanosoma bruceiinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - GIOVANNA CESARO.pdfapplication/pdf5232615https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/55171/1/R%20-%20D%20-%20GIOVANNA%20CESARO.pdf26d7fe39b516c8e76946caee0b4f78d3MD51open access1884/551712023-01-26 17:29:49.59open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/55171Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082023-01-26T20:29:49Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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