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Aristóbolo Mendes da Silvahttp://lattes.cnpq.br/5906229927639166http://lattes.cnpq.br/4274499330406568Brener Cunha Carvalho2020-07-29T18:26:41Z2020-07-29T18:26:41Z2014-07-24http://hdl.handle.net/1843/33875O reconhecimento de patógenos, um evento essencial para o início das respostas do sistema imune inato, é mediado por receptores de reconhecimento padrão (PRRs) como os receptores do tipo toll (TLRs). A sinalização celular disparada por meio dos TLRs leva à ativação de vários fatores de transcrição, que por sua vez participam da regulação de genes relacionados à resposta inflamatória. Um fator de transcrição central nesse contexto é o NF-kappaB, que precisa ser devidamente modulado por diversos mecanismos, pois a sua desregulação desempenha um papel fundamental em diversas patologias. Portanto, o melhor entendimento dos mecanismos de modulação de NF-κB pode fornecer novas abordagens terapêuticas para diversas doenças. RAP2A pertence à superfamília Ras, um grupo de proteínas envolvidas em diversos processos celulares e que têm sua atividade regulada por moléculas denominadas GEFs e GAPs. Estudos desenvolvidos em nosso laboratório demonstram que um GEF denominado RasGEF1B é codificado por um gene de expressão induzida por agonistas TLRs e apresenta um papel regulador negativo sobre a ativação de NF-κB mediada por TLRs (Andrade et al, 2010; Rocha, 2014). Em 2009, Yaman e colaboradores (Yaman et al, 2009) descreveram RAP2A como uma molécula efetora de RasGEF1B. Assim, hipotetizamos que, por ser efetor de RasGEF1B, RAP2A também desempenhe uma função regulatória importante sobre a atividade de NF-κB. Logo, o objetivo principal desse trabalho foi avaliar o efeito de RAP2A sobre a regulação da ativação de NF-κB na via de sinalização celular disparada por TLRs. Primeiramente, determinamos por meio de PCR o perfil de expressão de RAP2A em resposta à estimulação com agonistas de TLRs em linhagens de macrófagos murinos e monócitos humanos. Interessantemente, os níveis de RAP2A já se encontram elevados nas células não-estimuladas, porém são drasticamente reduzidos logo após a estimulação com agonistas TLRs. A partir de estudos de transfecção e ensaios de gene repórter, mostramos que a superexpressão de RAP2A inibe a ativação de NF-κB induzida por diversas moléculas como TNF, proteínas da via de sinalização dos TLRs e agonistas de TLRs, exceto pelo agonista de TLR3. Nossos dados suportam a ideia que RAP2A seja uma molécula importante que contribua para a regulação da ativação de NF-κB na resposta imune mediada pelos TLRs, e que a redução de sua expressão logo após a exposição das células a agonistas inflamatórios seja um evento crítico para permitir que a ativação de NF-κB seja bem sucedidaPathogen recognition, a key event for the initiation of innate immune response, is mediated by pattern-recognition receptors (PRRs) such as toll-like receptors (TLRs). Cell signaling triggered through TLRs leads to the activation of several transcription factors, which in turn participate in the regulation of genes related to inflammatory response. A critical transcription factor in this context is the NF-kB, which needs to be properly modulated by several mechanisms, as its dysregulation plays a key role in several diseases. Therefore, a better understanding of NF-кB modulation mechanisms may provide new therapeutic approaches for various diseases. RAP2A belongs to the Ras superfamily, a group of proteins involved in various cellular processes which have their activity regulated by molecules called GEFs and GAPs. Studies in our laboratory demonstrate that a GEF called RasGEF1B is encoded by a TLR-inducible gene and has a negative regulatory role on the NF-кB activation mediated by TLRs (Andrade et al, 2010; Rocha et al., 2014). In 2009, Yaman and colleagues (Yaman et al, 2009) described RAP2A as a RasGEF1B effector molecule. Thus, we hypothesized that RAP2A also plays an important regulatory role on the activity of NF-kB. Therefore, the main objective of this study was to evaluate the effect of RAP2A in the regulation of NF-kB activation in cell signaling pathways triggered by TLRs. First, we determined by RT-PCR and RT-qPCR the expression profile of RAP2A in response to stimulation with TLR agonists on murine macrophages and human monocytes. Interestingly, RAP2A levels are already elevated in unstimulated cells, but are dramatically reduced after TLR agonists stimulation. In transfection studies and reporter gene assays, we evaluated the effect of RAP2A on the NF-кB activation induced by various molecules such as TNF, TLRs agonists and downstream proteins of the TLRs signaling pathway. The results show that when overexpressed, RAP2A inhibits the activation of NFkappaB induced by these molecules, except by TLR3 agonist. Our data support the idea that RAP2A is an important molecule that contributes to the regulation of NF-kappaB activation in the immune response mediated by TLRs, and that a repression in its expression after exposure of cells to inflammatory agonists is a critical event to allow a successful activation of NF-kappaB.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas GeraisCAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorINCT – Instituto nacional de ciência e tecnologia (Antigo Instituto do Milênio)porUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Biologia CelularUFMGBrasilICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAShttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/info:eu-repo/semantics/openAccessBiologia CelularReceptores Toll-LikeNF-kappa BProteínas rasBiologia CelularAnálise dos efeitos de RAP2A sobre a ativação do fator de transcrição NF-kappaB na via de sinalização celular dos receptores do tipo Toll (TLRs)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALDissertação de Mestrado Brener Cunha Carvalho.pdfDissertação de Mestrado Brener Cunha Carvalho.pdfapplication/pdf1700459https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/33875/1/Disserta%c3%a7%c3%a3o%20de%20Mestrado%20Brener%20Cunha%20Carvalho.pdf6fb52439136b202f6bcccb31e1300122MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/33875/2/license_rdfcfd6801dba008cb6adbd9838b81582abMD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82119https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/33875/3/license.txt34badce4be7e31e3adb4575ae96af679MD531843/338752020-07-29 15:26:41.602oai:repositorio.ufmg.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2020-07-29T18:26:41Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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