Implicação da GTPase Rap2a na imunidade inata: expressão, ativação e seu papel em macrófagos ativados por receptores do tipo Toll (TLRs)

• Autor(a) principal: Brener Cunha Carvalho
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/35355
• topic: Biologia celular; Sistema imunitário; Noxas; Receptores de reconhecimento depadrão; Receptores Toll-like; GTP fosfo-hidrolases; Macrófagos

Uma das funções essenciais do sistema imune inato é o reconhecimento de patógenos, realizado por receptores de reconhecimento padrão (PRRs) presente em diversas células como macrófagos e neutrófilos. Os PRRs mais estudados são os receptores do tipo toll (TLRs). A sinalização celular disparada por TLRs leva à ativação de vários fatores de transcrição, que por sua vez regulam diversos genes relacionados à resposta inflamatória. Um fator de transcrição central nesse contexto é o NF-κB, cuja ativação precisa ser devidamente modulada, pois a sua desregulação desempenha um papel fundamental em diversas patologias. São poucos os estudos que relacionam Ras GTPases, proteínas envolvidas principalmente na migração e proliferação celular, às vias de TLRs e à ativação de NF-кB. Entretanto, já foi demonstrado que Rap1 é uma GTPase ativada na via de TLR4 e que a ativação de NF-кB é atenuada em macrófagos com perda de função de Rap1. As proteínas Rap1 e Rap2 possuem uma alta similaridade e embora já tenha sido demonstrado o envolvimento de Rap1 na ativação de NF-кB mediada por TLRs, não existem dados sobre as proteínas Rap2 no mesmo contexto. Ainda, abordagens bioquímicas já haviam demonstrado que Rap2a é ativado por RasGEF1b, um gene induzido por agonistas de TLRs. Portanto, o objetivo principal do presente trabalho foi investigar o envolvimento de Rap2a na resposta imune inata mediada por receptores do tipo Toll (TLRs). Primeiramente, determinamos por RT-qPCR que os níveis do mRNA de Rap2a são reduzidos em resposta à estimulação com agonistas de TLRs em macrófagos murinos imortalizados (RAW264.7) e macrófagos murinos de medula óssea (BMDMs) . Por ensaios de Western Blot, verificamos que a expressão proteica de Rap2a também é alterada em células RAW264.7 após estímulos com agonistas de TLRs. De forma intrigante, observamos que não há correlação direta entre o perfil de expressão do mRNA e da proteína de Rap2a após os tratamentos com agonistas de TLRs. Ademais, demonstramos por ensaios de pull-down que Rap2a é ativado após estímulos com LPS em células RAW264.7 e BMDMs. Ainda, demonstramos em BMDMs desprovidos de RasGEF1b que a ativação de Rap2a é reduzida em comparação às células selvagens. Os resultados sugeriram uma implicação de Rap2a em vias disparadas por TLRs. Assim, realizamos experimentos a fim de obter dados funcionais para Rap2a nesse contexto. Inicialmente, realizamos transfecções com siRNA para o silenciamento de Rap2a em macrófagos RAW264.7. A partir de ensaios de gene repórter, observamos que a ativação de NF-кB após estímulos com LPS é xvi reduzida nas células RAW264.7 transfectadas com siRNA-Rap2a quando comparadas às transfectadas com siRNA-controle. Ademais, análises por RT-qPCR e ELISA mostraram que há diminuição na produção de CXCL1 e IL-6 nos macrófagos murinos transfectados com siRNA-Rap2a. Ainda, avaliamos o efeito da superexpressão de Rap2a sobre a ativação de NF-κB induzida por diversas moléculas como agonistas de TLRs e proteínas a jusante da via de sinalização iniciada nos TLRs. De maneira interessante, os resultados mostraram que a superexpressão de Rap2a também reduz a ativação de NF-кB induzida por essas moléculas, exceto pelo agonista de TLR3. Em conjunto, nossos resultados demonstram de maneira inédita que Rap2a é uma GTPase implicada na resposta imune inata em vias desencadeadas por TLRs em macrófagos.