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Vívian Vasconcelos Costa6010924145549202Michelle Adriane Amantéa SugimotoVanessa Pinho da SilvaJordana Grazziela Alves Coelho dos Reis8442885164969466Carla Elizabeth Cunha Machado2023-04-12T14:54:13Z2023-04-12T14:54:13Z2021-05-28http://hdl.handle.net/1843/518550000-0002-0529-1404Estudos em humanos são limitados por questões éticas e técnicas. Dessa forma, o uso de camundongos como modelos in vivo e ex vivo, tem proporcionado grandes avanços nas pesquisas, porém ainda não são o suficiente. Assim, o desenvolvimento de camundongos humanizados (hu-camundongos) e sua utilização se faz relevante onde não há outro modelo animal adequado disponível para a pesquisa. Hu-camundongos são definidos como camundongos reconstituídos com células ou tecidos de origem humana e representam uma inovadora ferramenta de estudo in vivo do papel exercido pelo sistema imune humano durante a fisiopatologia de diferentes condições, assim como uma nova abordagem para o estudo da resposta imune humana com potencial translacional e avaliação de novos alvos terapêuticos, principalmente no que concerne a patógenos cujo tropismo é exclusivo das células humanas, como é o caso do vírus da dengue. Assim sendo, o objetivo desse estudo foi estabelecer um modelo de sistema imune humano em camundongos NOD scid IL-2Rγnull (NSG) para avaliação de novos alvos terapêuticos contra a dengue. Para tanto, foram testadas e avaliadas três diferentes fontes de células humanas para humanização dos animais: 1) células tronco progenitoras CD34+ provenientes de fígado fetal humano; 2) células tronco progenitoras CD34+ provenientes de bolsa de leucoaférese enriquecida com GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) e, 3) PBMC (células mononucleares do sangue periférico) humano de doadores saudáveis e seus respectivos controles não injetados. As duas primeiras estratégias não resultaram em resultados satisfatórios, o que inviabilizou a continuidade dos experimentos. Assim, a próxima fonte de células foi PBMC’s humanos e, com este modelo, seguimos com os experimentos. Os animais NSG foram injetados com PBMC’s e a presença de células humanas no sangue periférico dos animais foi avaliada semanalmente através de citometria de fluxo. Nossos resultados demonstram que os animais enxertados com PBMC’s humanos apresentaram um percentual médio de reconstituição de células humanas CD45+ superior a 40%, critério utilizado para considerarmos a humanização satisfatória. A avaliação foi feita no sangue, baço e fígado e as células T foram o tipo celular predominantes encontrados nesses sítios. A avaliação histopatológica do fígado demonstrou um recrutamento celular composto por células humanas. Além disso, nossos dados demonstraram que a humanização a partir de PBMC’s não foi associada a perda de peso, morte ou alterações nos parâmetros sanguíneos dos animais. Uma vez atingida a frequência média de 40% de células humanas circulantes, os camundongos humanizados, doravante chamados hu-camundongos, foram infectados por DENV-2 (dengue vírus-2) e acompanhados os parâmetros inflamatórios, histopatológicos, hematológicos e clínicos. A infecção dos hu-camundongos não foi associada a perda de peso ou morte. No entanto, a avaliação dos parâmetros sanguíneos demonstrou que houve uma diminuição de monócitos e aumento de plaquetas no sangue dos animais infectados quando comparados aos não infectados. Entretanto, não houve diferença significativa no percentual de hematócrito e nos níveis circulantes de linfócitos e neutrófilos em relação aos grupos infectados versus não infectados. Adicionalmente, foi possível observar aumento na produção de INFγ (interferon gama) somente nas células TCD4 do baço dos humanizados animais infectados. Os parâmetros histopatológicos avaliados revelaram que houve um recrutamento de células para o tecido e que essas células eram humanas. De modo geral, tal modelo parece ser uma boa estratégia para avaliação de novos alvos terapêuticos contra doenças virais com tropismo por células humanas, em especial, linfócitos humanos, e será mais explorado em nosso laboratório futuramente, podendo expandir nossas investigações para teste de outros patógenos com tropismo por células humanas.Human studies are limited by ethical and technical issues. Thus, the use of mice as in vivo and ex vivo models has provided great advances in research, but they are still not enough. Thus, the development of humanized mice (hu-mice) and their use becomes relevant where there is no other suitable animal model available for research. Hu-mice are defined as mice reconstituted with cells or tissues of human origin and represent an innovative in vivo study tool of the role played by the human immune system during the pathophysiology of different conditions, as well as a new approach to the study of the human immune response with translational potential and evaluation of new therapeutic targets, especially regarding to pathogens whose tropism is exclusive to human cells, such as the dengue virus. Therefore, the aim of this study was to establish a human immune system model in NOD-scid IL-2Rγnull (NSG) mice to evaluate new therapeutic targets against dengue. Therefore, three different sources of human cells for the humanization of animals were tested and evaluated: 1) CD34+ progenitor stem cells from human fetal liver; 2) CD34+ progenitor stem cells from a leukopheresis pouch enriched with GM-CSF (granulocyte and macrophage colony stimulating factor) and 3) human PBMC (peripheral blood mononuclear cells) from healthy donors and their respective non-injected controls. The first two strategies did not result in satisfactory results, which made the continuation of the experiments unfeasible. Thus, the next source of cells was human PBMC's and, with this model, we continued with the experiments. NSG animals were injected with PBMC's and the presence of human cells in the animals' peripheral blood was evaluated weekly by flow cytometry. Our results demonstrate that animals grafted with human PBMC’s presented an average percentage of human CD45+ cell reconstitution higher than 40%, a criterion used to consider humanization satisfactory. The evaluation was done in blood, spleen and liver and T cells were the predominant cell type found in these sites. Histopathological evaluation of the liver demonstrated a cell recruitment composed of human cells. Furthermore, our data demonstrated that humanization from PBMC's was not associated with weight loss, death or changes in blood parameters of animals. Once the average frequency of 40% of circulating human cells was reached, the humanized mice, hereinafter called hu-mice, were infected by DENV-2 (dengue virus-2) and the inflammatory, histopathological, hematological and clinical parameters were monitored. Infection of mice hu was not associated with weight loss or death. However, the evaluation of blood parameters showed that there was a decrease in monocytes and an increase in platelets in the blood of infected animals when compared to non-infected ones. However, there was no significant difference in the percentage of hematocrit and circulating levels of lymphocytes and neutrophils in relation to the infected versus non-infected groups. Additionally, it was possible to observe an increase in the production of INFγ (interferon gamma) only in the TCD4 cells of the spleen of humanized infected animals. The evaluated histopathological parameters revealed that there was a recruitment of cells to the tissue and that these cells were human. In general, this model seems to be a good strategy for evaluating new therapeutic targets against viral diseases with tropism for human cells, in particular human lymphocytes, and will be further explored in our laboratory in the future, which may expand our investigations to test other pathogens with tropism for human cells.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoporUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Biologia CelularUFMGBrasilICB - DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIABiologia CelularDengue/etiologiaCamundongos transgênicosDrogas em InvestigaçãoBiologia celularDengue/etiologiaCamundongos trangênicosDrogas em investigaçãoEstabelecimento de um modelo humanizado em camundongos NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) com potencial translacional para avaliação de novos alvos terapêuticosEstablishment of a humanized model in NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) mice with translational potential for evaluation of new therapeutic targetsinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALDISSERTAÇÃO VERSÃO FINAL - CARLA ELIZABETH CUNHA MACHADO.pdfDISSERTAÇÃO VERSÃO FINAL - CARLA ELIZABETH CUNHA MACHADO.pdfapplication/pdf75514121https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/51855/1/DISSERTAC%cc%a7A%cc%83O%20VERSA%cc%83O%20FINAL%20-%20CARLA%20ELIZABETH%20CUNHA%20MACHADO.pdf0db012696920d67fd9f49c37aa6a6f36MD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82118https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/51855/2/license.txtcda590c95a0b51b4d15f60c9642ca272MD521843/518552023-04-12 11:54:14.116oai:repositorio.ufmg.br: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ório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2023-04-12T14:54:14Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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