Choque térmico no desenvolvimento in vitro de oócitos e embriões bovinos e estratégias para incrementar a qualidade embrionária

• Autor(a) principal: Ana Carolina Leite
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/34423
• topic: Vacas leiteiras; Embriões; Reprodução animal; Reprodução animal

O estresse térmico por calor (EC) provoca redução da fertilidade nas fêmeas bovinas, especialmente nas vacas leiteiras. Sabe-se que a exposição a temperaturas ambientais elevadas afeta adversamente a qualidade e competência de desenvolvimento de oócitos e embriões. Substâncias citoprotetoras, quando adicionadas à alimentação animal ou a meios de produção de embrião, podem incrementar a qualidade e a resistência embrionária a injúrias causadas por estresse térmico. A suplementação do meio de cultivo de embriões bovinos com ácido linoleico trans-10, cis-12 (CLA) exógeno pode alterar o perfil lipídico das células embrionárias interferindo na competência de desenvolvimento dos mesmos quando expostos a temperaturas adversas. O presente trabalho visa explorar fatores determinantes de respostas à exposição de oócitos e embriões bovinos a temperatura de incubação elevada, bem como estabelecer estratégias para diminuir danos do estresse térmico ao desenvolvimento embrionário. No experimento 1 foi testado a concentração mais adequada de Butirolactona I (BUT-I) para manter os oócitos em estádio de imaturidade, sem comprometer a retomada da meiose posteriormente. Foram testadas quatro concentrações de BUT-I (10µM, 25µM, 50µM e 100µM), comparando-se com oócitos imaturos (tratamento Imaturo) e com oócitos maturados (Controle). A concentração de 50µM de BUT-I mostrou-se mais adequada em promover a inibição reversível da meiose, apresentando taxas de clivagem (92,5%) e de produção de embrião (50,5%) superior à encontrada para as demais concentrações de BUT-I (P<0,05; Taxa de clivagem 60,6%, 31,3% e 64,2% respectivamente para BUT10µM, BUT25µM e BUT100µM; Taxa de Produção de embrião de 32,1% para BUT10µM, 17,6% para BUT25µM e 34,4% para BUT100µM) e semelhelhante ao controle nos oócitos submetidos à produção de embrião após o fim do bloqueio. Nos experimentos 2 e 3 oócitos e embriões bovinos, divididos em cinco tratamentos, foram submetidos a estresse térmico por calor (EC) por elevação da temperatura de incubação, em diferentes estádios de desenvolvimento. No Controle, oócitos e embriões foram cultivados a 38,5ºC durante todas as etapas da produção in vitro de embriões (PIVE). No tratamento vesícula germinativa (VG), oócitos foram mantidos por 12 horas em estádio de vesícula germinativa, por indução farmacológica com Butirolactona-I (BUT-I) e, em seguida, foram submetidos à PIVE em condições convencionais de temperatura (38,5ºC). No tratamento VGEC, oócitos mantidos em vesícula germimativa foram expostos a choque térmico (41ºC por 12h) durante a pré-maturação e, em seguida, submetidos à PIVE convencional. No tratamento MIVEC os oócitos foram submetidos a choque térmico durante as primeiras 12 horas de maturação (41ºC por 12h seguido de 38,5ºC por 12h) e, em seguida, submetidos à fecundação e cultivo em condições de termoneutralidade (38,5ºC). No tratamento D7EC foram submetidos às 12h de choque térmico embriões de 144 horas de desenvolvimento pós-inseminação, em seguida foram submetidos à 12h de cultivo em condições convencionais de temperatura. Embriões produzidos a partir de oócitos imaturos expostos a calor excessivo (VGEC) apresentaram menor atividade mitocondrial em relação a embriões submetidos à EC no estádio de blastocisto (P<0,05), entretanto se mostrou semelhante ao Controle e demais tratamentos no parâmetro avaliado. Houve redução dos estoques citoplasmáticos de lipídeos em embriões provenientes de oócitos ou embriões submetidos à EC (nº de gotículas lipídicas 964,6; 1.484,2; 788,1 para os tratamentos VGEC, MIVEC e D7EC, respectivamente) em relação aos tratamentos Controle e VG (P<0,05). Em relação ao percentual da área embrionária ocupada por gotículas lipídicas o tratamento VGEC apresentou o menor teor de lipídeos entre os tratamentos avaliados (P<0,05; % área do embrião ocupada por lipídeos de 19,0% para Controle, 15,4% para VG, 8,1% para VGEC,16,5% para MIVEC e 17,1% para D7EC). Foram encontradas diversas alterações morfofuncionais relacionadas com qualidade, metabolismo e implantação embrionária, como alterações ultraestruturais de mitocôndrias e microvilosidades e aumento de vacuolizações citoplasmáticas. O tratamento VGEC foi o mais afetado pelo choque térmico de acordo com os parâmetros relacionados com o desenvolvimento embrionário, apresentando redução das taxa de clivagem, produção de embrião e eclosão em relação ao Controle (P<0,05). Os resultados encontrados evidenciam que os oócitos de folículos ovarianos em estágios iniciais de crescimento são especialmente sensíveis aos danos causados pelo calor excessivo. No experimento 4 foi adicionado ao meio de cultivo in vitro o CLA com o objetivo de modular a deposição lipídica intracitoplasmática e aumentar a resistência embrionária ao choque térmico. Os embriões cultivados na presença do CLA apresentaram menor acúmulo de lipídeos (P<0,05; área média ocupada por lipídeos de 272.554,5; 301.960,7 e 413.124,9 para os grupos CLA, CLA+SFB e Contole, respectivamente). Entretanto, o incremento na qualidade embrionária não foi suficiente para aumentar a sobrevivência dos mesmos, demonstrado pela taxa de reexpansão embrionária superior para o Controle (70,4%) em relação aos tratamentos SFB+CLA (43,3%) e CLA (47,1%). Oócitos e embriões submetidos a choque térmico vivenciam alterações importantes na dinâmica citoplasmática e na morfofuncionalidade de organelas como mitocôndrias e microvilosidades embrionárias que podem estar diretamente relacionadas com a diminuição da sobrevivência embrionária pós-exposição ao calor excessivo.