| spelling |
Stefan Michael Geigerhttp://lattes.cnpq.br/3636034702659396Edward José de OliveiraRafaella Fortini GrenfellDeborah Aparecida Negrão-Corrêahttp://lattes.cnpq.br/7278120774878617Karine Ferreira Lopes2024-03-04T15:45:08Z2024-03-04T15:45:08Z2020-02-19http://hdl.handle.net/1843/65119A esquistossomose mansoni é uma doença de evolução crônica, causada pelo parasito Schistosoma mansoni, que ainda representa um sério problema de saúde pública no Brasil. O diagnóstico laboratorial da esquistossomose mansoni, realizado por meio da detecção de ovos do parasito nas fezes, apresenta baixa sensibilidade quando aplicado em indivíduos com baixa carga parasitária, o que dificulta o controle e erradicação da doença. Os testes sorológicos podem ser mais sensíveis para o diagnóstico da infecção, principalmente quando se faz uso de antígenos recombinantes. Esses antígenos podem conter epítopos específicos de uma ou mais proteínas, aumentando a sensibilidade e especificidade do teste. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi desenvolver e avaliar um ensaio imunoenzimático de ELISA, usando um antígeno multiepítopos, produzido através da tecnologia do DNA recombinante. Para isso, as sequências de aminoácidos da catepsina B e da asparaginil endopeptidase de S. mansoni foram submetidas à predição de epítopos de células B usando os preditores BepiPred 2.0 e o método de antigenicidade descrito por Kolaskar & Tongaonkar, para selecionar as regiões peptídicas com maior potencial antigênico. Juntamente com sequências peptídicas obtidas de trabalhos anteriores, estas foram retrotraduzidas em sequências nucleotídicas e utilizadas na construção de um minigene. O minigene foi inserido no plasmídeo pET28a e a construção foi transformada em E. coli BL21(DE3) pLysS, para produção do antígeno multiepítopos em larga escala. Após análise de solubilidade, o antígeno recombinante foi purificado por cromatografia de afinidade com resina sensibilizada com níquel, em condições desnaturantes. Em seguida, esse antígeno foi renaturado por meio de diálise contra soluções de ureia em concentrações decrescentes. Esse antígeno foi utilizado para sensibilizar microplacas de poliestireno em uma concentração ótima, previamente determinada por titulação em bloco contra diferentes diluições de soros controles positivos, negativos e conjugado anti-IgG-peroxidase, para padronizar um ensaio de ELISA, denominado ELISA IgG anti-SmME. O desempenho do ELISA IgG anti-SmME foi avaliado em usando 118 amostras de soro de participantes positivos e negativos para esquistossomose, além de amostras de participantes com outras helmintoses. Posteriormente, o ensaio foi aplicado em amostras de indivíduos antes e após três, seis e doze meses de tratamento com praziquantel, para avaliar o nível de anticorpos IgG em indivíduos ovo-negativos e reinfectados. Usando um ponto de corte definido pela análise da curva ROC (Receiver Operating Curve), o ELISA IgG anti-SmME apresentou sensibilidade de 68%, especificidade de 66% e acurácia diagnóstica de 67%. A maioria dos participantes com esquistossomose mansoni apresentou baixa carga parasitária. Nesses participantes o ELISA IgG anti-SmME apresentou 68% de sensibilidade na detecção dos indivíduos com ≤ 12 opg (ovos por grama de fezes) e 67% na detecção dos indivíduos com 13-99 opg. Nos pacientes ovo-positivos para S. mansoni e tratados com praziquantel, não foi possível observar queda nos níveis de anticorpos, mesmo até 12 meses após tratamento. Vale destacar que esse foi o primeiro estudo usando um antígeno recombinante multiepítopos no ensaio de ELISA, para diagnóstico da esquistossomose mansoni. O mesmo demonstrou aplicabilidade no diagnóstico de indivíduos com baixa carga parasitária. Nesse sentido, novos trabalhos deverão ser realizados para melhorar o desempenho do ELISA IgG anti-SmME e torná-lo uma alternativa para o diagnóstico laboratorial da esquistossomose mansoni.Intestinal schistosomiasis is a chronic disease, caused by the parasite Schistosoma mansoni, which still represents a serious public health problem in Brazil. The laboratory diagnosis of intestinal schistosomiasis, carried out by detecting parasite eggs in feces, has low sensitivity when applied to individuals with low parasitic load, which represents an obstacle for control and eradication of the disease. Serological tests can be more sensitive for the diagnosis of infection, especially when using recombinant antigens. These antigens can contain specific epitopes of one or more proteins, increasing the sensitivity and specificity of the test. Therefore, the objective of this work was to develop and evaluate an ELISA-based immunoenzymatic assay, using a multi-epitope antigen, produced with recombinant DNA technology. For this, the amino acid sequences of S. mansoni cathepsin B and asparaginyl endopeptidase were submitted for the prediction of B cell epitopes using the BepiPred 2.0 and the antigenicity prediction method described by Kolaskar & Tongaonkar, to select the peptide regions with higher antigenic potential. Together with peptide sequences obtained from previous works, these sequences were backtranslated into nucleotide sequences and used in the construction of a minigene. The minigene was inserted into plasmid pET28a and the construct was transformed into E. coli BL21 (DE3) pLysS, for large-scale production. After solubility analysis, the recombinant antigen was purified under denaturing conditions by nickel-sensitized resin affinity chromatography. Then, the antigen was renatured by means of dialysis against urea solutions in decreasing concentrations. This antigen was used to coat polystyrene microplates in an optimal concentration, previously determined by block titration against different dilutions of positive, negative control sera and anti-IgG-peroxidase conjugate, to standardize an ELISA assay, called ELISA IgG anti-SmME. The performance of the ELISA IgG anti-SmME was evaluated using sera from 118 positive and negative individuals for schistosomiasis. In addition, samples from individuals with other helminths were used. Subsequently, the assay was tested against serum samples from individuals before and three, six and twelve months after treatment with praziquantel, to assess the level of IgG antibodies in egg-negative and reinfected individuals. The cut-off point was defined by ROC (Receiver Operating Curve) analysis and the ELISA IgG anti-SmME resulted in a sensitivity of 68%, specificity of 66% and diagnostic accuracy of 67%. Most of the S. mansoni-infected individuals had a low parasitic burden. In their serum samples, the ELISA IgG anti-SmME showed 68% sensitivity for individuals with egg counts of ≤ 12 epg (eggs per gram feces) and 67% for individuals with 13-99 epg. In egg- positive individuals treated with praziquantel, no drop in antibody reactivity was observed, even up to 12 months after treatment. It is worth mentioning that, for the diagnosis of intestinal schistosomiasis, this was the first study using a multi-epitope recombinant antigen in an ELISA assay. It demonstrated applicability in the diagnosis of individuals with low parasitic load. In this sense, further work should be carried out to improve the performance of the ELISA IgG anti-SmME and make it an alternative for the laboratory diagnosis of schistosomiasis.FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas GeraisOutra AgênciaporUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em ParasitologiaUFMGBrasilICB - DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIAParasitologiaSchistosoma mansoniDiagnósticoSorologiaCarga ParasitáriaEpitoposSchistosoma mansoniDiagnósticoAntígeno multiepítoposSorologiaBaixa carga parasitáriaDesenvolvimento e avaliação de um ensaio imunoenzimático, usando antígeno multiepítopos, para o diagnóstico laboratorial da esquistossomose mansoniinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALDissertaçãoFinal_KarineLopes.pdfDissertaçãoFinal_KarineLopes.pdfapplication/pdf3924614https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/65119/1/Disserta%c3%a7%c3%a3oFinal_KarineLopes.pdf21397268ac6a3aa4ef2effc9f6be47fdMD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82118https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/65119/2/license.txtcda590c95a0b51b4d15f60c9642ca272MD521843/651192024-03-04 12:45:08.799oai:repositorio.ufmg.br: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ório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2024-03-04T15:45:08Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
|