Estudos sobre os mecanismos de recombinação em trypanosoma cruzi: obtenção e análise de células superexpressando o gene TcRaD51

• Autor(a) principal: Danielle Gomes Passos Silva
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8RAJ8F
• topic: Bioquímica e imunologia; Bioquímica

Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas. Somente poucos genes envolvidos no metabolismo de DNA foram descritos nessa espécie. Recentemente, nosso grupo caracterizou em T. cruzi, o gene codificador para uma das principais proteínas envolvidas na recombinação homóloga, a proteína TcRad51. Visando entender melhor o papel de Rad51 em processos de recombinação nesse parasita, esse gene foi superexpresso no clone CL Brener de T. cruzi. Após a verificação da superexpressão do mRNA de TcRad51 nas culturas transfectadas através da técnica de northern blot, esses parasitos foram submetidos a agentes que causam quebras de fita dupla, tais como a radiação gama e a droga zeocina. Foi observado que a superexpressão de TcRad51 aumenta a resistência a esses agentes. Além disso, foi verificado que esse aumento corresponde a uma cinética de recuperação mais rápida do DNA fragmentado nos parasitos transfectados, observada através de eletroforese em campo pulsátil. Além do seu papel no reparo de quebra de fita dupla, o envolvimento do gene TcRad51 no processo de recombinação foi avaliado em ensaios de transfecção e integração de fragmentos exógenos no genoma do parasita. Parasitos selvagens e superexpressando TcRad51 foram transfectados com plasmídeo contendo o gene de resistência ao antibiótico G418 e da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) e sequências homólogas ao gene de tubulina. Verificou-se que a superexpressão de TcRad51 resulta em aumento do número de clones resistentes a G418 e capazes de expressar GFP, os quais, provavelmente, tiveram o plasmídeo integrado no locus de tubulina. Nós também obtivemos clones derivados de culturas transfectadas superexpressando TcRad51. Os clones apresentaram níveis variáveis de expressão de TcRad51, mas não demonstraram diferenças em seu crescimento quando comparados com a população transfectada e as células selvagens. Novas análises com esses clones deverão contribuir para investigar melhor a importância de Rad51 na manutenção da estabilidade genômica desse parasita e no metabolismo de DNA em T. cruzi