Caracterização de genes de Trypanosoma cruzi envolvidos na via de biossíntese de glicosilfosfatidilinositol

• Autor(a) principal: Mariana Santos Cardoso
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9FDFF6
• topic: Bioquímica e Imunologia; Tripanossoma cruzi; Bioquímica; Biossíntese; Glicosilfosfatidilinositol

Glicosilfosfatidilinositol (GPI) é a estrutura predominante das âncoras utilizadas pelo Trypanosoma cruzi para expressar proteínas em sua superfície, muitas delas essenciais para a virulência do parasito ou para seu escape da resposta imune do hospedeiro. Além disso, âncoras GPI de T. cruzi exercem atividades imunoestimulatórias e regulatórias, incluindo a indução da síntese de citocinas pró-inflamatórias por macrófagos do hospedeiro. Portanto, os genes codificadores de enzimas e outros fatores envolvidos na biossíntese de âncoras GPI de T. cruzi são alvos potencialmente atrativos para o desenvolvimento de novas drogas contra a doença causada pelo parasito, conhecida como doença de Chagas. Assim, o objetivo desse projeto foi investigar a via de biossíntese das âncoras GPI, por meio da caracterização bioquímica e funcional dos genes que codificam os componentes dessa via. Para isso, as sequências desses genes, obtidas em bancos de dados do genoma do T. cruzi, foram analisadas e os produtos desses genes avaliados por (i) complementação heteróloga em mutantes condicionalmente letais de Saccharomyces cerevisiae, (ii) ensaios de expressão gênica bem como de localização celular no parasito e (iiii) análise do fenótipo de parasitos nocautes para alguns desses genes. As análises in silico das sequências disponíveis no banco de dados do genoma do T. cruzi (TriTrypDB) resultaram na identificação de 18 genes que codificam proteínas da via de biossíntese de GPI, bem como do gene da inositolfosforilceramida sintase (IPCS). Sequências correspondentes aos genes TcDPM1, TcGPI3 e TcGPI12 de T. cruzi, expressas em epimastigotas em fusão com GFP, apresentaram uma localização celular compatível com o retículo endoplasmático. Análises dos níveis de RNA de TcGPI8 e TcGPI10 indicaram um aumento da expressão em epimastigotas e amastigotas, os dois estágios proliferativos do parasito. Análises de leveduras deficientes em vários genes da via biossintética de GPI e transformadas com os respectivos genes de T. cruzi mostraram que os genes TcDPM1, TcGPI10 e TcGPI12 foram capazes de restaurar o crescimento desses mutantes em condições não permissivas, indicando que essas proteínas são homólogas às de leveduras. Proteínas recombinantes foram também obtidas em bactérias com o objetivo de desenvolver estudos sobre suas estruturas. Para investigar o papel de proteínas ancoradas a GPI de T. cruzi, o gene TcGPI8, que codifica a subunidade catalítica do complexo que catalisa a última etapa da via, foi deletado. Apesar de terem sido gerados parasitos apresentando um dos alelos deletados, nos quais a diminuição nos níveis de expressão dos mRNAs de TcGPI8 foi observada, várias tentativas de deletar o segundo alelo de TcGPI8 resultaram em parasitos com a inserção dos genes de resistência a droga nos dois alelos, mas que apresentavam rearranjos no genoma e, em consequência, ainda expressavam o mRNA de GPI8. A caracterização desses parasitos mutantes de TcGPI8 indicou que, apesar deles apresentarem somente pequenas alterações na composição do glicocálix, os efeitos dessas alterações na sua capacidade infectiva foram bastante evidentes. Dessa forma, além de aprofundar o conhecimento sobre os componentes da via de biossíntese de âncoras GPI, que parece ser essencial para a sobrevivência do parasito, o presente trabalho possibilitou a geração de mutantes de leveduras complementados com genes ortólogos de T. cruzi, os quais se tornam valiosas ferramentas a serem utilizadas em ensaios de screening em larga escala para a descoberta de novas drogas para o tratamento da doença de Chagas.