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Marco Antonio Maximo PradoLuiz Armando Cunha De MarcoWALDEREZ ORNELAS DUTRAVILMA REGINA MARTINSRAFAEL LINDENAna Cristina Ribeiro Magalhaes2019-08-11T02:11:44Z2019-08-11T02:11:44Z2005-03-29http://hdl.handle.net/1843/SMOC-6XLP4MA proteína prion celular (PrPsen ou PrPc) é uma proteína expressa em vários tipos celulares, especialmente em neurônios. Esta proteína apresenta uma estrutura rica em alfa hélices, no entanto pode sofrer uma mudança de conformação secundária gerando uma isoforma conhecida como PrPres (ou PrPsc). Esta isoforma apresenta uma estrutura predominante de folhas beta e adquire a capacidade de se associar formando amilóides, bem como resistência a tratamento com proteases. Através de um mecanismo biológico ainda pouco esclarecido, PrPres é capaz de promover a conversão de moléculas dePrPsen para PrPres. A formação e deposição de agregados insolúveis de PrPres no sistema nervoso estão relacionados a uma série de doenças neurodegenerativas raras e fatais. A internalização e tráfego intracelular destas isoformas podem revelar informações importantes sobre o papel fisiológico de PrPsen, bem como os mecanismos de infecção e propagação de PrPres entre células. Interessados nestes mecanismos, nosso grupo construiu uma versão da proteína prion celular ligada a green fluorescent protein (GFP) para monitorarmos a distribuição, endocitose e tráfego desta proteína em célulasneuronais SN56 vivas. Células SN56 expressando esta proteína de fusão (GFP-PrPc) apresentaram a fluorescência distribuída pela membrana plasmática e em compartimentos intracelulares próximos ao núcleo, de maneira similar a proteína endógena. GFP-PrPc foi internalizada e direcionada para uma região perinuclear na presença de cobre, indicando um papel importante deste íon na fisiologia de PrPc. Um mutante de deleção N-terminal (aminoácidos 32 a 121) ligado a GFP apresentou maior acúmulo na membrana plasmática e menor concentração na região perinuclear, sugerindo uma deficiência na endocitose. Além disso, o cobre não foi capaz de induzir aendocitose deste mutante, indicando que a região N-terminal é importante para a endocitose constitutiva e induzida por cobre de PrPc. Experimentos de dupla marcação indicaram que a região perinuclear positiva para GFP-PrPc era constituída de endossomas de reciclagem e Golgi. O mecanismo de endocitose de GFP-PrPc também foi avaliado e a endocitose constitutiva e induzida por cobre de GFP-PrPc foi dependente de dinamina I. Células expressando o fragmento C terminal da proteína AP180, que compete com a proteína endógena responsável pelo recrutamento de clatrina para a membrana plasmática, xivapresentam 75% de inibição da endocitose dependente de clatrina. Nestas células, a endocitose constitutiva de GFP-PrPc não sofreu alteração e a induzida por cobre apresentou uma inibição parcial, sugerindo que o mecanismo de endocitose de GFPPrPc é complexo, podendo envolver tanto um mecanismo dependente comoindependente de clatrina. Provavelmente, o mecanismo independente não envolve caveolae, já que não pudemos detectar caveolina, um marcador para caveolae, em células SN56. Nós também avaliamos a internalização e tráfego de PrPres usando diferentes cepas de PrPres conjugadas à molécula fluorescente alexa568. Células SN56 foram capazes de processar agregados da cepa de PrPres Chandler de camundongo distribuindo a fluorescência em vesículas espalhadas pelo citoplasma e neuritos. Outras cepas de PrPres, 263K e 87V, não foram processadas e internalizadas com a mesma eficiênciaem células SN56. As células incubadas com Chandler PrPres foram capazes de produzir novas moléculas de PrPres, indicando que estavam infectadas persistentemente, enquanto as cepas 263K e 87V não foram capazes de infectar estas células. Estes dados mostram que a endocitose e tráfego de PrPres foram coincidentes com a infecção dascélulas, sugerindo que as vias utilizadas por PrPres para internalizar e trafegar na célula podem ter importância neste processo. As vesículas de Chandler PrPres colocalizaram com marcadores para endossomastardios e lisossomas (dextran e lisotracker) e não colocalizaram com marcadores da via clássica de clatrina (transferrina) ou vesículas provenientes de endocitose por lipid rafts (toxina da cólera) indicando que após internalização provavelmente por um mecanismo independente de clatrina ou rafts, Chandler PrPres é direcionado paraorganelas acídicas. A expressão do mutante constitutivamente ativo de Rab 7 (GFPRab7 Q67L) confirmou que PrPres está presente em endossomas tardios e lisossomas no corpo e neuritos. Em neuritos, Chandler PrPres não colocalizou com GFP-VAChT, um marcador de vesículas sinápticas. Experimentos com outra linhagem celular (N2a)persistentemente infectada por PrPres indicaram alteração na formação de PrPres na presença de mutantes de Rab 7. Estes dados com Rab7 em SN56 e N2a infectadas sugerem que o tráfego de PrPres pelos endossomas tardios e lisossomas pode ter uma participação no processo de formação de novas moléculas de PrPres.Cellular prion protein (PrPsen ou PrPc) is expressed in a wide variety of cells, specialy neurons. This protein is rich in alpha helix structures, but it can assume an alternative conformational isoform known as PrPres (or PrPsc). PrPres presents mainly beta sheet structure and gains the ability to form aggregates as well as is protease resistant. PrPres is able to propagate by converting PrPsen molecules to the alternative conformation isoform PrPres in a new biologic mechanism, not yet fully understood. Then, PrPres molecules form aggregates that accumulates in the brain causing Prion Diseases, a group of neurodegenerative disorders very rare and fatal. PrPsen and PrPres internalization and subsequent intracellular trafficking may give important sights about the physiological role of PrPsen and the mechanisms of PrPres infection and propagation between cells. In order to pursue these mechanisms, we used a GFP-tagged version of the mouse cellular prion protein. This construction allowed us to check PrPsen distribution and follow its endocytosis and traffic in a living neuronal cell line, SN56. SN56 cells expressing GFP-PrPc showed fluorescence signal distributed at theplasma membrane and in intracellular compartments localized close to the nucleus, similarly to endogenous protein. In response to copper treatment, GFP-PrPc was internalized and directed to a perinuclear region, suggesting that Cu2+ may have an important role in PrPsen physiology. We also examined the steady state distribution of aN-terminal deletion mutant of PrPsen (Ä32 121) tagged with GFP. This mutant showed an accumulation at the plasma membrane and weak labeling of the perinuclear region suggesting an endocytosis deficiency. This mutant did not show internalization after copper treatment suggesting that N-terminal region may be involved with PrPsenendocytosis. Organelle specific markers suggest that the perinuclear region labeled with GFP-PrPc is composed of recycling endosomes and Golgi. We also evaluate the mechanism involved in GFP-PrPc endocytosis and our data suggests that dynamin I is important to both, constitutive and copper induced GFP-PrPc endocytosis. Cells expressing a C-terminal fragment of AP-180, a protein that recruits clathrin to the plasma membrane, showed 75% inhibition of clathrin dependentendocytosis. In these conditions, constitutive endocytosis of GFP-PrPc was not altered and the copper induced internalization showed a partial inhibition. These data suggest xvi that GFP-PrPc may present a complex endocytosis mechanism involving clathrin dependent and independent pathways. The clathrin independent mechanism does not involve caveolae, since we failed to detect caveolin, a caveolae marker, in SN56 cells. We also examined PrPres internalization and intracellular trafficking by labeling several PrPres strains with the fluorescent dye alexa568. SN56 cells were able to take up Chandler PrPres from aggregates and distribute this fluorescent protein in vesicles inside the cell body and neuritis. However, those cells were not able to internalize PrPres of other strains, like 263K and 87V, with the same efficiency seen for ChandlerPrPres. Moreover, cells treated with Chandler PrPres showed formation of new PrPres molecules, suggesting the establishment of a sustained infection, while cells treated with either 263K or 87V PrPres did not show PrPres formation. These observations suggest that uptake and intracellular trafficking of PrPres coincide with sustained infection inSN56 neuronal cells. Thus, the mechanisms and pathways taken by PrPres may be important to the establishment of a sustained infection.Chandler PrPres positive vesicles spread in the cell body and neuritis co-localized with late endosomes and lysosomes markers (dextran and lysotracker) and failed to colocalize with markers of clathrin dependent endocytosis (transferrin) or lipid raft endocytosis (cholera toxin), suggesting that those vesicles are directed to acidic organelles after internalization probably using a clathrin and raft independentmechanism. Chandler PrPres positive vesicles did not colocalize with GFP-VAChT, a marker for sinaptic vesicles, in neuritis or cell body.Overexpression of a constitutively active GTP-bound Rab7 fused to GFP (GFPRab7 Q67L) showed that Chandler PrPres localizes in late endosomes and lysosomes in the cell body and neuritis. Expression of Rab7 and mutants in another cell line persistently infected with PrPres (N2a) showed alteration of new PrPres formation. The results with infected SN56 and N2a expressing Rab7 mutants suggest that trafficking in late endosomes and lysosomes may play an important role in sustained PrPres formation.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGDoenças de príonPrionsProteínasEndocitoseInfecçãoDoenças neurodegenerativasPrionTráfego de proteínasEndocitoseInternalização e tráfego de PrPsinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALtesefinalcorrigida_aninha.pdfapplication/pdf6802248https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/SMOC-6XLP4M/1/tesefinalcorrigida_aninha.pdf1ca8a5a47b5a401dddaf6e4e501df64bMD51TEXTtesefinalcorrigida_aninha.pdf.txttesefinalcorrigida_aninha.pdf.txtExtracted texttext/plain230975https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/SMOC-6XLP4M/2/tesefinalcorrigida_aninha.pdf.txt90a165f542fb51dbcb0b91ca374b2e82MD521843/SMOC-6XLP4M2019-11-14 04:34:29.632oai:repositorio.ufmg.br:1843/SMOC-6XLP4MRepositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T07:34:29Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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