Internalização e tráfego de PrPs

• Autor(a) principal: Ana Cristina Ribeiro Magalhaes
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/SMOC-6XLP4M
• topic: Infecção; Doenças neurodegenerativas; Prion; Tráfego de proteínas; Endocitose; Doenças de príon; Prions; Proteínas; Endocitose

A proteína prion celular (PrPsen ou PrPc) é uma proteína expressa em vários tipos celulares, especialmente em neurônios. Esta proteína apresenta uma estrutura rica em alfa hélices, no entanto pode sofrer uma mudança de conformação secundária gerando uma isoforma conhecida como PrPres (ou PrPsc). Esta isoforma apresenta uma estrutura predominante de folhas beta e adquire a capacidade de se associar formando amilóides, bem como resistência a tratamento com proteases. Através de um mecanismo biológico ainda pouco esclarecido, PrPres é capaz de promover a conversão de moléculas dePrPsen para PrPres. A formação e deposição de agregados insolúveis de PrPres no sistema nervoso estão relacionados a uma série de doenças neurodegenerativas raras e fatais. A internalização e tráfego intracelular destas isoformas podem revelar informações importantes sobre o papel fisiológico de PrPsen, bem como os mecanismos de infecção e propagação de PrPres entre células. Interessados nestes mecanismos, nosso grupo construiu uma versão da proteína prion celular ligada a green fluorescent protein (GFP) para monitorarmos a distribuição, endocitose e tráfego desta proteína em célulasneuronais SN56 vivas. Células SN56 expressando esta proteína de fusão (GFP-PrPc) apresentaram a fluorescência distribuída pela membrana plasmática e em compartimentos intracelulares próximos ao núcleo, de maneira similar a proteína endógena. GFP-PrPc foi internalizada e direcionada para uma região perinuclear na presença de cobre, indicando um papel importante deste íon na fisiologia de PrPc. Um mutante de deleção N-terminal (aminoácidos 32 a 121) ligado a GFP apresentou maior acúmulo na membrana plasmática e menor concentração na região perinuclear, sugerindo uma deficiência na endocitose. Além disso, o cobre não foi capaz de induzir aendocitose deste mutante, indicando que a região N-terminal é importante para a endocitose constitutiva e induzida por cobre de PrPc. Experimentos de dupla marcação indicaram que a região perinuclear positiva para GFP-PrPc era constituída de endossomas de reciclagem e Golgi. O mecanismo de endocitose de GFP-PrPc também foi avaliado e a endocitose constitutiva e induzida por cobre de GFP-PrPc foi dependente de dinamina I. Células expressando o fragmento C terminal da proteína AP180, que compete com a proteína endógena responsável pelo recrutamento de clatrina para a membrana plasmática, xivapresentam 75% de inibição da endocitose dependente de clatrina. Nestas células, a endocitose constitutiva de GFP-PrPc não sofreu alteração e a induzida por cobre apresentou uma inibição parcial, sugerindo que o mecanismo de endocitose de GFPPrPc é complexo, podendo envolver tanto um mecanismo dependente comoindependente de clatrina. Provavelmente, o mecanismo independente não envolve caveolae, já que não pudemos detectar caveolina, um marcador para caveolae, em células SN56. Nós também avaliamos a internalização e tráfego de PrPres usando diferentes cepas de PrPres conjugadas à molécula fluorescente alexa568. Células SN56 foram capazes de processar agregados da cepa de PrPres Chandler de camundongo distribuindo a fluorescência em vesículas espalhadas pelo citoplasma e neuritos. Outras cepas de PrPres, 263K e 87V, não foram processadas e internalizadas com a mesma eficiênciaem células SN56. As células incubadas com Chandler PrPres foram capazes de produzir novas moléculas de PrPres, indicando que estavam infectadas persistentemente, enquanto as cepas 263K e 87V não foram capazes de infectar estas células. Estes dados mostram que a endocitose e tráfego de PrPres foram coincidentes com a infecção dascélulas, sugerindo que as vias utilizadas por PrPres para internalizar e trafegar na célula podem ter importância neste processo. As vesículas de Chandler PrPres colocalizaram com marcadores para endossomastardios e lisossomas (dextran e lisotracker) e não colocalizaram com marcadores da via clássica de clatrina (transferrina) ou vesículas provenientes de endocitose por lipid rafts (toxina da cólera) indicando que após internalização provavelmente por um mecanismo independente de clatrina ou rafts, Chandler PrPres é direcionado paraorganelas acídicas. A expressão do mutante constitutivamente ativo de Rab 7 (GFPRab7 Q67L) confirmou que PrPres está presente em endossomas tardios e lisossomas no corpo e neuritos. Em neuritos, Chandler PrPres não colocalizou com GFP-VAChT, um marcador de vesículas sinápticas. Experimentos com outra linhagem celular (N2a)persistentemente infectada por PrPres indicaram alteração na formação de PrPres na presença de mutantes de Rab 7. Estes dados com Rab7 em SN56 e N2a infectadas sugerem que o tráfego de PrPres pelos endossomas tardios e lisossomas pode ter uma participação no processo de formação de novas moléculas de PrPres.