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Aristóbolo Mendes da Silvahttp://lattes.cnpq.br/5906229927639166http://lattes.cnpq.br/1851446863675819Sérgio Queirós Lima2023-08-02T15:48:52Z2023-08-02T15:48:52Z2023-05-24http://hdl.handle.net/1843/57350Slfn4 e Serpinb2 são genes expressos em macrófagos que podem ter seus níveis de mRNA aumentados em resposta à estimulação por agonistas inflamatórios de receptores do tipo Toll. Em análises de sequenciamento global de RNAs, um cluster contendo Slfn4 e Serpinb2 indica que a expressão desses encontra-se reduzida na ausência do fator de troca de nucleotídeos guanina RasGEF1b em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos estimulados com LPS. No entanto, não se encontra completamente estabelecido como a expressão de Slfn4 é regulada em macrófagos condições de repouso ou inflamatórias, enquanto que Serpinb2 não possui evidências conclusivas. Ademais, permanece por ser estabelecida a caracterização do promotor de Slfn4 com os seus sítios de ligação para fatores de transcrição e sua consequente ativação transcricional, e o papel de RasGEF1b sobre a regulação transcricional de Serpinb2. Baseado nesses questionamentos, nós testamos a hipótese que o RasGEF1b regula a expressão de Slfn4 e Serpinb2 em macrófagos. Análises por RT-qPCR confirmam que os níveis do Slfn4 e Serpinb2 são reduzidos em macrófagos RasGEF1b-KO não tratados ou tratados com LPS, e o efeito da ausência de RasGEF1b sob a expressão gênica observada em células não estimuladas é mantido após o tratamento com LPS. A expressão de Slfn4, Serpinb2 e genes do cluster também foram reduzidos em níveis basais em macrófagos RAW264.7 silenciados para RasGEF1b tratados e não tratados com LPS. Porém, em Ch25h foi identificado o efeito reverso. Análises dos motivos de ligação para fatores de transcrição específicos na região promotora putativa de Slfn4, Serpinb2 e de genes do mesmo cluster revelaram a presença dos motivos para os fatores reguladores IRFs, AP-1, STATs, ATF e GATA. De acordo, os níveis de Slfn4 e Serpinb2 em macrófagos de RasGEF1b-KO ativados com LPS e IFN mantiveram-se em níveis reduzidos e comparáveis aos de células não estimuladas. A super expressão de RasGEF1b induziu a atividade transcricional de Serpinb2, enquanto a mesma foi reduzida em macrófagos RAW264.7 silenciados para RasGEF1b. A mutação nos sítios de ligação para os fatores de transcrição CEBP e AP-1 reduziu a atividade de luciferase do promotor de Serpinb2 em células HEK293 super expressando RasGEF1b por 24 horas, mas não em 48 horas para o sitio mutado de CEBP. Nossos resultados sugerem que RasGEF1b facilita a transcrição gênica de Slfn4 e Serpinb2 em níveis suficientes para permitir sua expressão em níveis máximos após a ativação celular por agentes inflamatórios.Slfn4 and Serpinb2 are genes expressed in macrophages that can have their mRNA levels increased in response to stimulation by inflammatory agonists of Toll-like receptors. In analyzes of global sequencing of RNAs, a cluster containing Slfn4 and Serpinb2 indicates that their expression is reduced in the absence of the guanine nucleotide exchange factor RasGEF1b in stimulated mouse bone marrow-derived macrophages with LPS. However, it is not fully established how Slfn4 expression is regulated in macrophages at rest or under inflammatory conditions, while Serpinb2 lacks conclusive evidence. Furthermore, the characterization of the Slfn4 promoter with its binding sites for transcription factors and its consequent transcriptional activation, and the role of RasGEF1b on the transcriptional regulation of Serpinb2 remains to be established. Based on these questions, we tested the hypothesis that RasGEF1b regulates the expression of Slfn4 and Serpinb2 in macrophages. RT-qPCR analyzes confirm that Slfn4 and Serpinb2 levels are reduced in untreated or LPS-treated RasGEF1b-KO macrophages, and the effect of the absence of RasGEF1b on gene expression observed in unstimulated cells is maintained after LPS treatment. Expression of Slfn4, Serpinb2, and cluster genes were also reduced from baseline levels in LPS-treated and untreated RAW264.7 macrophages silenced to RasGEF1b. However, at Ch25h the reverse effect was identified. Analysis of the binding motifs for specific transcription factors in the putative promoter region of Slfn4, Serpinb2 and genes from the same cluster revealed the presence of motifs for the interferon regulatory factors IRFs, AP-1, STATs, ATF and GATA. Accordingly, Slfn4 and Serpinb2 levels in RasGEF1b-KO macrophages activated with LPS and IFN remained at low levels, comparable to those of unstimulated cells. Overexpression of RasGEF1b induced transcriptional activity of Serpinb2, whereas it was reduced in RAW264.7 macrophages silenced for RasGEF1b. Mutation in the binding sites for the CEBP and AP-1 transcription factors reduced the luciferase activity of the Serpinb2 promoter in HEK293 cells overexpressing RasGEF1b for 24 hours, but not at 48 hours for the mutated CEBP site. Our results suggest that RasGEF1b facilitates gene transcription of Slfn4 and Serpinb2 at sufficient levels to allow their expression at maximum levels after cellular activation by inflammatory agents.porUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Biologia CelularUFMGBrasilBiologia CelularFatores de Troca do Nucleotídeo GuaninaProteínas rasMacrófagosExpressão GênicaRASGEF1BMACRÓFAGOSEXPRESSÃO GENICAPapel do fator de troca de nucleotídeos guanina RASGEF1B na regulação da expressão de SCHLAFEN-4 e SERPINB2 em macrófagosinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALTESE final - Sergio LIMA.pdfTESE final - Sergio LIMA.pdfapplication/pdf4011673https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/57350/1/TESE%20final%20-%20Sergio%20LIMA.pdf71a59a9e889400189ec08ebf023d81c7MD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82118https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/57350/2/license.txtcda590c95a0b51b4d15f60c9642ca272MD521843/573502023-08-02 12:48:52.779oai:repositorio.ufmg.br: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ório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2023-08-02T15:48:52Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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