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Vanessa Pinho da Silva-Fabiana Simão Machadohttp://lattes.cnpq.br/2341866067511648http://lattes.cnpq.br/7397855204653536Barbara Maximino Rezende Gonçalves2023-10-20T16:00:14Z2023-10-20T16:00:14Z2016-08-17http://hdl.handle.net/1843/59796A doença do enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) ainda é a principal limitação do sucesso do transplante de medula óssea que é realizado para tratar doenças hematológicas malignas e não malignas. A terapia imunossupressora utilizando corticoides é o tratamento padrão e de primeira escolha para evitar o desenvolvimento da GVHD. Entretanto, a toxicidade dos esteroides, a resposta limitada dessas drogas, os pacientes que desenvolvem GVHD refratária a esteroides e a interferência no efeito enxerto-versus-tumor são os grandes desafios dessas terapias. Dessa forma, o estudo de mecanismos de desencadeamento da doença e a proposta de novas estratégias terapêuticas são de extrema importância. O leucotrieno B4 (LTB4), produzido a partir do metabolismo do ácido araquidônico pela ação catalítica da 5-lipoxigenase (5-LO), é um mediador pró-inflamatório e está associado com o desenvolvimento de várias doenças inflamatórias, incluindo a GVHD intestinal em humanos. Entretanto, o papel de LTB4 na fisiopatologia da GVHD permanece pouco compreendido. Neste trabalho, nós avaliamos a participação do eixo 5-LO/LTB4 na fisiopatologia da GVHD por meio do transplante de leucócitos deficientes em 5-LO ou a inibição farmacológica da via pelo tratamento com zileuton, uma droga comumente utilizada para o tratamento de pacientes asmáticos. Para verificar a nossa hipótese de que 5-LO participa da GVHD, nós induzimos a doença pelo transplante de 1x107 células de medula óssea e 3x107 esplenócitos isolados de camundongos selvagens ou de camundongos deficientes em 5-LO para camundongos receptores B6D2F1. Camundongos que receberam células da medula óssea e esplenócitos de camundongos singênicos (B6D2F1) não desenvolveram a doença e foram considerados o grupo controle. Para inibição farmacológica de 5-LO, a GVHD foi induzida e os camundongos receptores foram tratados com zileuton (30mg/kg, oralmente, de 12h/12h a partir do dia do transplante). Os camundongos foram monitorados a cada 2 dias para verificação da sobrevivência e sinais clínicos da GVHD. Em experimentos diferentes, o fígado, o intestino e os órgãos linfoides dos animais foram retirados e processados para análise histopatológica, quantificação de citocinas e quimiocinas e acúmulo de leucócitos. O recrutamento e a adesão de leucócitos foram avaliados por microscopia intravital nas vênulas mesentéricas. A expressão intestinal e hepática do mRNA de 5-LO também foi avaliada no início da mortalidade por PCR em tempo real. Os níveis de LTB4 foram avaliados no sangue, no fígado e no intestino de camundongos submetidos à GVHD por ensaio imunoenzimático. Além disso, avaliamos a proporção de células H2B+ e H2B+2D+ nos animais receptores e o fenômeno do enxerto-versus-leucemia (GVL) por citometria de fluxo. Embora não tenha sido observado um aumento na expressão do mRNA de 5-LO no jejuno-íleo e no fígado de camundongos submetidos à GVHD no início da mortalidade, o transplante de esplenócitos semi alogênicos deficientes em 5-LO reduziu os níveis séricos e hepáticos de LTB4 e a lesão no intestino e no fígado. Estes resultados foram associados à inibição de leucócitos pró-inflamatórios e à diminuição dos níveis de citocinas e quimiocinas. O tratamento com zileuton também reduziu os parâmetros inflamatórios associados à GVHD. Além disso, o transplante de células deficientes em 5-LO ou o tratamento com zileuton não interferiu na reconstituição da medula óssea e no efeito GVL e reduziu os sinais clínicos da doença, aumentando a taxa de sobrevivência nos animais submetidos à GVHD. Estes dados em conjunto, evidenciam a participação do eixo 5-LO/LTB4 no desenvolvimento da doença do enxerto-versus-hospedeiro, sugerindo potencial aplicação terapêutica de zileuton para o tratamento da doença em pacientes submetidos ao transplante de medula óssea.Unfortunately, graft-versus-host disease (GVHD) remains the major limitation of bone marrow transplant to treat patient with malignant and non-malignant hematological diseases. The first-line treatment for GVHD are steroids such as methylprednisolone or prednisone because of the broad anti- inflammatory and lymphocytotoxic effects of these drugs. However, steroid-refractory GVHD patients are at high risk of related complications from the disease or death and there is no standard treatment strategy for these patients. Thus, new therapies are necessary. The leukotriene B4 (LTB4) is a pro- inflammatory mediator produced from arachidonic acid metabolism by 5-lipoxygenase (5-LO) catalytic action and is associated with the development of various inflammatory diseases including intestinal GVHD in humans. However, the role of LTB4 in the GVHD pathophysiology is incompletely understood. In this report we evaluated the participation of the 5-LO/LTB4 axis in pathogenesis of GVHD by transplant of 5-LO deficient leukocytes and the effect of its pharmacological inhibition by zileuton, a drug usually employed to treat asthmatic patients. To test our hypothesis that 5-LO participates to GVHD, we induced the disease in mice by the transplant of 1x107 bone marrow cells plus 3x107 splenocytes from WT or 5LO-/- mice to B6D2F1 mice. Mice that received syngeneic (B6D2F1) bone marrow cells and splenocytes not develop disease and were considered the control group. After transplant, intestinal and hepatic mRNA expression of 5-LO was evaluated by Real Time PCR. The levels of LTB4 were evaluated in the blood, liver and intestine by enzymatic immune assay. To pharmacological inhibition of 5-LO, GVHD was induced and recipient mice treated by zileuton (30mg/kg, orally, 12h/12h). Mice were monitored every 2 days for survival and GVHD clinical signs. The liver and intestine were also subjected to histopathology analysis, ELISA, NAG and flow cytometry. The leukocytes recruitment and adhesion were assessed by intravital of mesenteric venules. The chimerism, the accumulation of inflammatory cells in the lymphoid organs and the GVL reaction were evaluated by FACS analysis in the spleen and bone marrow. Although we did not observe an increase of 5-LO mRNA in the jejunum ileum and liver in mice subjected to GVHD at onset mortality, the transplant of semi-allogenic 5-LO deficient splenocytes reduced the serum and hepatic level of LTB4 and the intestinal and liver injury. These results were associated with inhibition of proinflammatory leukocytes and decreased levels of cytokines and chemokines. In addition, treatment with zileuton also effectively ammeliorates the disease by reduction of liver and serum LTB4 and diminution of the inflammatory response in the intestine and liver. Importantly, mice that received 5LO-deficient cells or zileuton-treated mice had prolonged survival and reduced GVHD clinical scores. Moreover, the transplant of 5LO-/- leukocytes or zileuton-treated mice did not interfere in the chimerism or in the GVL response. Taken together, these data provide evidence that 5-LO/LTB4 axis orchestrates the GVHD development, describing a potential therapeutic application of zileuton to GVHD treatment.porUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Biologia CelularUFMGBrasilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/info:eu-repo/semantics/openAccessCamundongosMedula ÓsseaEnxerto-Versus-Hospedeiro (GVHD)Medula ósseaCamundongosParticipação da via de 5-Lipoxigenase no desenvolvimento da doença do Enxerto-Versus-Hospedeiro (GVHD) em camundongos: Novas possibilidadeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALtese Barbara-final corrigida pós banca.pdftese Barbara-final corrigida pós banca.pdfapplication/pdf12951520https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/59796/1/tese%20Barbara-final%20corrigida%20p%c3%b3s%20banca.pdf5accbd7e138389609157ed72d24e9857MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/59796/2/license_rdfcfd6801dba008cb6adbd9838b81582abMD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82118https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/59796/3/license.txtcda590c95a0b51b4d15f60c9642ca272MD531843/597962023-10-20 13:00:15.023oai:repositorio.ufmg.br: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ório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2023-10-20T16:00:15Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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