Purificação e caracterização parcial de uma serino-protease tipo tripsina isolada do intestino de larvas de Lutzomyia longipalpis (Diptera, Psychodidae)

• Autor(a) principal: Kleber Portela Fortes
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-979FUT
• topic: Digestão de proteínas; Tripsina; Lutzomyia longipalpis; Parasitologia

A Leishmaniose Visceral é uma doença de grande impacto à saúde pública. No Novo Mundo é causada por Leishmania infantum e transmitida principalmente por Lutzomyia longipalpis. Em flebotomíneos adultos, as tripsinas desempenham um importante papel durante o processo de digestão sanguínea, entretanto, pouco se sabe a respeito da ação destas proteases nas formas imaturas. Neste trabalho foi realizado um processo de purificação e caracterização de uma enzima semelhante à tripsina de intestino médio de L. longipalpis. Ensaios enzimáticos na presença de benzamidina (inibidor de tripsina) demonstraram que a atividade tripsinolítica é responsável por maior parte da digestão de proteínas totais (58%) quando comparadas com a atividade quimotripsinolítica (42%). O processo de purificação por cromatografia de afinidade (coluna de p-aminobenzamidina) permitiu a obtenção de frações com atividade tripsinolítica (substrato: L-BApNA), que revelou por SDS-PAGE uma única banda de massa molecular de 20,6 kDa. A análise com benzamidina em SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina, bem como ensaios enzimáticos na presença de diversos inibidores indicou que a enzima é uma protease semelhante à tripsina. Ensaios realizados em diferentes faixas de pH demonstraram que a atividade proteolítica máxima ocorre em pH 9,5. A atividade específica encontrada foi de 2511,5 U.mg-1 e o fator de purificação 46,1 vezes. Na determinação cinética, o valor de Km utilizando L-BApNA foi de 0,49 mM. Em análise por espectrometria de massa do material purificado, foi detectada a massa de 23311,88 Da (MALDI-TOF). Com relação ao efeito da concentração de íons metálicos (Ca2+ e Mg2+) e EDTA, verificou-se uma diminuição da atividade tripsinolítica apenas quando EDTA era adicionado aos ensaios em concentrações iguais ou maiores a 18,75 mM, não havendo interferência por parte dos íons metálicos. Este é o primeiro trabalho que relata a purificação e caracterização de uma tripsina digestiva em larvas de L. longipalpis.