Racionalizando a utilização do algoritmo PHRED para a análise de seqüências de DNA

• Autor(a) principal: Francisco Prosdocimi de Castro Santos
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/GRFO-7ZGK4Q
• topic: Algoritmo PHRED; sequênciamento de DNA; Bioinformática; Sequenciamento e análise de cDNAs; Algoritmos geneticos

A ciência é, por vezes, dogmática. Mesmo o cientista questionador às vezes é obrigadoa tomar como verdade algo que se acredita na comunidade de forma a realizar suaspesquisas em busca do conhecimento. Na área da genômica, alguns dogmas estãoainda arraigados à cultura científica e o objetivo principal da presente tese foi tentar,na medida do possível, questionar e testar alguns desses dogmas com a intenção detrazer à luz da razão um conhecimento mais sólido sobre alguns limitados aspectosrelacionados, principalmente, ao processo de nomeação das bases (base-calling). Paraavaliar, portanto, a utilização do algoritmo PHRED, o principal nomeador de basesutilizado em projetos genoma, desenvolvemos primeiro uma metodologia sólida deanálise. Tal metodologia tentou diminuir o número de variáveis a se analisar em umacorrida de seqüenciamento para que nossas análises não levassem em consideraçãopeculiaridades específicas de uma ou outra reação produzida. Dessa forma, realizamoso seqüenciamento de um vetor de clonagem bastante conhecido (pUC18) em um únicoconjunto, homogeneizando as amostras de forma que a única variável possível fosse aseparação eletroforética e o padrão de nomeação de bases. Produzimos, portanto, 846seqüências do vetor pUC18 que foram comparadas, através de alinhamentos locais,com um controle positivo: a seqüência já publicada para esta molécula. Dessa forma,pudemos identificar os erros do seqüenciamento / nomeação de bases e avaliardiferentes parâmetros de utilização do algoritmo PHRED. Verificamos que o padrão deerros observado era relativamente igual ao esperado, que as bases incorretas nãopodiam ser previstas através da observação dos valores de qualidade de suavizinhança e que as trocas (mismatches) são mais comuns quando associadas avalores baixos de qualidade, enquanto se nota a presença de erros relacionados aindels de alta qualidade. Percebemos também uma aplicação desta abordagem para oprocesso de desenho de iniciadores de seqüenciamento e realizamos um estudoavaliando este tópico, o qual mostra que a leitura de boa qualidade é iniciada a umadistância mensurável à jusante do iniciador de seqüenciamento. Com o objetivo detentar mascarar as bases incorretas em letras minúsculas, observamos que o valor dequalidade 7 parece ser o mais adequado para utilizar nesses casos, em boa parte dassituações. Além disso, calibramos o programa PHRED para funcionar de forma aapresentar apenas a informação não-ruidosa, biologicamente relevante. Por último,analisamos ainda a formação de consensos a partir dessas seqüências e mostramos asurpreendente ineficiência do re-seqüenciamento de forma a produzir seqüências fiéisà molécula molde.