Desenvolvimento de métodos de extração e derivatização para análises cromatográficas dos ácidos biliares e aminoácidos em estudos metabolômicos

• Autor(a) principal: Maria José Nunes de Paiva
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/SFSA-9MRRUQ
• topic: Ácidos biliares e aminoácidos; Estudos metabolômicos; Derivatização; Liquido cefalorraquidiano; Métodos cromatográficos; Micro-ondas; Cromatografia gasosa; Química analítica; Aminoácidos Metabolismo; Cromatografia de gás; Ácidos; Espectrometria de massa

Neste trabalho foram desenvolvidos e validados métodos cromatográficos para a quantificação de ácido biliares no plasma sanguíneo e aminoácidos no liquido cefalorraquidiano. Para a análise dos ácidos biliares e aminoácidos foram desenvolvidos métodos de preparo de amostras baseados na derivatização assistida por micro-ondas. Estas análises foram efetuadas por cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas. A derivatização dos ácidos biliares foi realizada por meio da metoximação e sililação. O tempo de reação a potencia do micro-ondas e a quantidade de derivatizante foram otimizadas para um melhor rendimento analítico. A melhor condição obtida foi a adição de 40 µL de BSTFA com aquecimento a uma potencia de 210 W por 3 min. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 0,78 e 20,0 µg mL-1 e o intervalo da precisão variou de 1,08 a 9,32%. O método de análise para determinação dos aminoácidos, após a validação, foi aplicado em amostras reais de líquido cefalorraquidiano de pacientes hospitalizados com suspeita de infecção fungica. O planejamento experimental mostrou que o tempo de derivação ideal foi de 3 min na potencia de 210W. Os limites de detecção encontrados foram de 0,01 µmol L-1 a 4,21 µmol L-1 e os limites de quantificação foram de 0,02 µmol L-1 a 7,07 µmol L-1. A precisão intra-ensaio variou de 4,12 a 15,59% e a interensaio de 6,36 a 18,71%. Para os aminoácidos todos os coeficientes de determinação ficaram acima de 0,990. Em seguida foi desenvolvido um método para análise dos ácidos biliares no plasma. Para a extração dos ácidos biliares presentes no plasma foi desenvolvido um método de microextração em fase líquida com fibra oca. A análise foi feita utilizando a cromatografia líquida de alto desempenho acoplada à espectrometria de massas. A otimização do procedimento de LPME em duas fases para a extração dos ácidos biliares apresentou limites de detecção entre 2,07 e 2,66 nmol L-1 e limites de quantificação entre 10,35 e 13,20 nmol L-1. A precisão intra-ensaio variou de 3,3 a 11,9% e a para a concentração de 25,0 µg L-1 e de 2,1 a 8,3% para a concentração de 100,0 µg L-1. O método apresentou linearidade no intervalo de 10,35 a 531,0 nmol L-1. A metodologia desenvolvida e validada foi aplicada à análise de ácidos biliares em plasma de trabalhadores expostos à solventes, e em voluntários não expostos. Os métodos desenvolvidos mostraram-se adequados para todas as determinações feitas no plasma e no líquido cefalorraquidiano. O método para análise de aminoácido utilizando derivatização assistida por micro-ondas mostrou ser simples, rápido, sensível e seletivo. O método para análise dos ácidos biliares por microextração em fase líquida apresentou elevada sensibilidade, baixo consumo de solventes, e boa recuperação.