A enzima 3-hidróxi-quinurenina transaminase de Aedes Aegypti como alvo de 1,2,4-oxadiazóis
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| Data de Publicação: | 2020 |
| Tipo de documento: | Tese |
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| Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPE |
| Texto Completo: | https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/38643 |
Resumo: | SILVA, Thereza Amélia Soares da, também é conhecido(a) em citações bibliográficas por: SOARES, Thereza Amélia; ANJOS, Janaína Versiani dos, também é conhecido(a) em citações bibliográficas por: DOS ANJOS, Janaína Versiani |
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O controle químico é a principal estratégia atual para a diminuição populacional do mosquito, apesar de induzir mecanismos de resistência a longo prazo nos insetos. Em muitos casos, os alvos destes inseticidas são vias bioquímicas importantes para o vetor, que uma vez alteradas, encerram o ciclo de vida dos mosquitos. Uma dessas vias em mosquitos é a via das quinureninas, que culmina com a transformação da 3-hidróxi-quinurenina em ácido xanturênico pela enzima 3-hidróxi-quinurenina transaminase (HKT). Trabalhos prévios do nosso grupo mostraram que compostos contendo o núcleo do 1,2,4-oxadiazol apresentam atividade larvicida com evidências de que estas moléculas são prováveis inibidoras da HKT. Para provar esta hipótese, decidimos investigar o potencial da HKT como alvo molecular de derivados 1,2,4- oxadiazólicos. Para este fim, a HKT de Aedes aegypti (AeHKT) foi expressa em Escherichia coli e sua estrutura 3D foi determinada por cristalografia de macromoléculas com difração de raios X. A clonagem, expressão heteróloga e purificação da HKT apresentou um rendimento máximo de 150 mg por litro de cultura. A triagem de mais de 1000 condições de cristalização resultou na coleta de 16 conjuntos de dados provenientes de cristais da HKT de duas linhagens de Aedes aegypti, RecLab (RL_AeHKT) e Rockefeller (R_AeHKT). Problemas com cristais geminados tornaram difíceis o processamento e refinamento do conjunto de dados, mas a determinação da estrutura da RL_AEHKT em resolução máxima de 2,5 Å foi finalizada e está disponível no Banco de Dados de Proteínas. Para avaliar o perfil cinético da HKT e a atividade inibitória dos 1,2,4-oxadiazóis, foi desenvolvida uma metodologia baseada na detecção do complexo ácido xanturênico-Fe3+ em 570 nm, tornando o ensaio mais rápido e de baixo custo. Deste modo, HKT expressa em bactéria exibiu uma constante de Michaelis-Menten de 3,3 mM e eficiência catalítica de 149 min-1.mM-1, sendo estes valores similares aos descritos na literatura. A série de onze sais orgânicos derivados de 1,2,4-oxadiazóis foi testada e seus valores de CI50 variaram entre 42 e 294 μM, se comportando como inibidores não-competitivos. A constante de inibição (KI) do composto canônico desta série foi estimada em 360 μM, valor bem próximo ao KI descrito para o inibidor cocristalizado da HKT de Anopheles gambiae (300 μM). Desta maneira, foi confirmado que os derivados 1,2,4-oxadiazólicos são inibidores da enzima HKT. Esta primeira série de inibidores da AeHKT servirá de modelo para o desenvolvimento de inibidores mais potentes para a HKT. A elucidação do modo de ligação destes compostos está sendo realizada por simulações computacionais visando a identificação de grupos funcionais importantes para o aumento a atividade inibitória em relação à HKT.CAPESCNPqThe Aedes aegypti mosquito is the vector of arboviruses such as dengue and Zika fever, diseases that affect many people mostly in tropical areas. The chemical control is the main current strategy to decrease mosquito population, despite the induction of long-term resistance mechanisms in the insects. In many cases, the targets of these insecticides are important biochemical pathways for the vector, which, once changed, finish the life cycle of the mosquitoes. One of these pathways in mosquitoes is the kynurenine pathway, which culminates in the transformation of 3-hydroxykynurenine to xanthurenic acid by the enzyme 3- hydroxykynurenine transaminase (HKT). Previous works from our group showed that compounds containing the 1,2,4-oxadiazolic nucleus show larvicidal activity with evidences that these molecules are probable HKT inhibitors. To prove this hypothesis, we decided to investigate the HKT potential as molecular target of 1,2,4-oxadiazoles derivatives. Towards this end, the HKT from Aedes aegypti was expressed in Escherichia coli and its 3D structure was determined by macromolecular crystallography through X-ray diffraction. The HKT cloning, heterologous expression and purification showed a maximum yield of 150 mg per liter of culture. The screening of more than 1000 crystallization conditions produced the collection of 16 datasets from HKT crystals of two Aedes aegypti lineages, RecLab (RL_AeHKT) and Rockefeller (R_AeHKT). Problems of twinned crystals became difficult the processing and refinement of the datasets, but the determination of RL_AeHKT structure was finished and it is available in Protein Data Bank. To access the HKT kinetic profile and 1,2,4-oxadiazoles inhibitory activity, a methodology was developed based on the detection of the complex xanthurenic acid-Fe3+ in 570 nm, making the fast and low-cost assay. Thus, the HKT expressed in bacteria exhibited a Michaelis-Menten constant of 3.3 mM and catalytic efficiency of 149 min-1.mM-1, which are similar values to those described in the literature. The series of eleven organic salts 1,2,4-oxadiazole derivatives was tested and their IC50 values ranged between 42 and 294 μM, behaving as noncompetitive inhibitors. The inhibition constant (KI) of the canonical compound from this series was estimated in 360 μM, very close value of the KI described to the cocrystallized inhibitor of HKT from Anopheles gambiae (300 μM). Therefore, it was confirmed that the 1,2,4-oxadiazole derivatives are inhibitors of the enzyme HKT. This first series of AeHKT inhibitors will serve as model for the development of more potent HKT inhibitors. The elucidation of the binding mode of these compounds is being carried out by computational simulations aiming the identification of critical functional groups to improve the inhibitory activity towards HKT.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em QuimicaUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessExpressão heteróloga de proteínasCristalografia de proteínasInibição enzimáticaA enzima 3-hidróxi-quinurenina transaminase de Aedes Aegypti como alvo de 1,2,4-oxadiazóisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisdoutoradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPECC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/38643/2/license_rdfe39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34MD52TEXTTESE Larissa Gonçalves Maciel.pdf.txtTESE Larissa Gonçalves Maciel.pdf.txtExtracted texttext/plain346748https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/38643/4/TESE%20Larissa%20Gon%c3%a7alves%20Maciel.pdf.txt628e418f25d09fcd517d7ec2d02cff46MD54THUMBNAILTESE Larissa Gonçalves Maciel.pdf.jpgTESE Larissa Gonçalves Maciel.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1208https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/38643/5/TESE%20Larissa%20Gon%c3%a7alves%20Maciel.pdf.jpg6c8845810f30d1a0980233f567a622b8MD55ORIGINALTESE Larissa Gonçalves Maciel.pdfTESE Larissa Gonçalves Maciel.pdfapplication/pdf12873545https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/38643/1/TESE%20Larissa%20Gon%c3%a7alves%20Maciel.pdff5653b31db3b71979144c87d3ba2efe5MD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; 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