Análise comparativa da atividade leishmanicida in vitro do ácido úsnico e do seu derivado usnato de potássio isolado da Cladonia substellata Vainio
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Data de Publicação: | 2019 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPE |
Texto Completo: | https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/35711 |
Resumo: | A leishmaniose apresenta-se como um grave problema de saúde pública em muitos países do mundo, afetando populações social e economicamente vulneráveis. A busca por novos fitoquímicos com ação antiparasitária, menor toxicidade e de baixo custo surge como uma alternativa aos tratamentos existentes. Alguns estudos mostraram que o ácido úsnico (AU) possui diversas atividades biológicas (antiproliferativa, antiviral, anti-inflamatória, antimicrobial e antiparasitária), no entanto apresenta elevada hepatotoxicidade e baixa solubilidade. A forma solúvel do AU, sal de potássio derivado do ácido úsnico (PS-UA) ou usnato de potássio, tem sido utilizada por alguns pesquisadores no intuito de aumentar sua eficácia e reduzir sua toxicidade. No presente estudo, objetivou-se analisar a atividade leishmanicida in vitro do AU e do PS-UA frente às formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e a citotoxicidade em macrófagos (RAW 264.7); assim como, avaliar se esses compostos interferem na morfologia do parasita. O AU foi isolado do extrato bruto do líquen Cladonia substellata Vainio e o PS-UA foi obtido a partir da salinização desse extrato. A atividade antiprotozoária do AU e do PS-UA contra formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi e a viabilidade celular foram avaliadas pelo ensaio do MTT. Análises estruturais e ultraestruturais dos parasitos foram realizadas através de microscopia eletrônica. Adicionalmente, neste estudo foi utilizada a técnica de eletroforese em gel bidimensional (2D) e espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF) com a finalidade de destacar e identificar proteínas diferencialmente acumuladas nas formas promastigotas dos parasitas sob ação do PS-UA (6,25 μg/mL). A IC50 do AU e do PS-UA frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi foram determinadas (18,30 ± 2,00 e 3,71 ± 2,99 μg/mL, respectivamente) e a concentração da IC₅₀ do PS-UA revelou ser sete vezes menos tóxica para os macrófagos (CC₅₀ = 26.31 ± 13.55 μg/mL, IS = 7). A análise dos parasitas pela microscopia eletrônica de varredura revelou alterações de superfície e de forma (conforme as concentrações de IC₅₀ determinadas). Foram observadas as seguintes alterações ultraestruturais: sob ação do AU detectou-se tumefação dos parasitas, perda de polaridade celular e aumento do número de vacúolos citoplasmáticos; já sob ação do PS-UA observou-se modificações na cromatina nuclear, intensa vacuolização citoplasmática, extensa tumefação mitocondrial, corpos lipídicos e vesículas elétron-densas por todo o citoplasma. Através da eletroforese (2D) foi observado um total de 450 spots proteicos e na análise comparativa dos perfis proteômicos entre as formas promastigotas tratadas com PS-UA e as formas não tratadas foram revelados 173 spots, sendo 81 spots encontrados exclusivamente no perfil proteico das formas não tratadas e 63 spots nas formas tratadas, com um acúmulo diferencial de 29 spots. Dentre as proteínas diferencialmente acumuladas, o Fator de Iniciação Traducional (IF-2), importante na síntese proteica, apresentou-se reduzido sob efeito do PS-UA. Na ontologia gênica para regulação de processos biológicos, verificou-se que o PS-UA exerceu considerável influência com relação à expressão de proteínas. O PS-UA foi eficaz contra as formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi sem causar toxicidade às células de mamíferos, destacando-se como uma nova proposta de fármacos leishmanicidas. |
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Alguns estudos mostraram que o ácido úsnico (AU) possui diversas atividades biológicas (antiproliferativa, antiviral, anti-inflamatória, antimicrobial e antiparasitária), no entanto apresenta elevada hepatotoxicidade e baixa solubilidade. A forma solúvel do AU, sal de potássio derivado do ácido úsnico (PS-UA) ou usnato de potássio, tem sido utilizada por alguns pesquisadores no intuito de aumentar sua eficácia e reduzir sua toxicidade. No presente estudo, objetivou-se analisar a atividade leishmanicida in vitro do AU e do PS-UA frente às formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e a citotoxicidade em macrófagos (RAW 264.7); assim como, avaliar se esses compostos interferem na morfologia do parasita. O AU foi isolado do extrato bruto do líquen Cladonia substellata Vainio e o PS-UA foi obtido a partir da salinização desse extrato. A atividade antiprotozoária do AU e do PS-UA contra formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi e a viabilidade celular foram avaliadas pelo ensaio do MTT. Análises estruturais e ultraestruturais dos parasitos foram realizadas através de microscopia eletrônica. Adicionalmente, neste estudo foi utilizada a técnica de eletroforese em gel bidimensional (2D) e espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF) com a finalidade de destacar e identificar proteínas diferencialmente acumuladas nas formas promastigotas dos parasitas sob ação do PS-UA (6,25 μg/mL). A IC50 do AU e do PS-UA frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi foram determinadas (18,30 ± 2,00 e 3,71 ± 2,99 μg/mL, respectivamente) e a concentração da IC₅₀ do PS-UA revelou ser sete vezes menos tóxica para os macrófagos (CC₅₀ = 26.31 ± 13.55 μg/mL, IS = 7). A análise dos parasitas pela microscopia eletrônica de varredura revelou alterações de superfície e de forma (conforme as concentrações de IC₅₀ determinadas). Foram observadas as seguintes alterações ultraestruturais: sob ação do AU detectou-se tumefação dos parasitas, perda de polaridade celular e aumento do número de vacúolos citoplasmáticos; já sob ação do PS-UA observou-se modificações na cromatina nuclear, intensa vacuolização citoplasmática, extensa tumefação mitocondrial, corpos lipídicos e vesículas elétron-densas por todo o citoplasma. Através da eletroforese (2D) foi observado um total de 450 spots proteicos e na análise comparativa dos perfis proteômicos entre as formas promastigotas tratadas com PS-UA e as formas não tratadas foram revelados 173 spots, sendo 81 spots encontrados exclusivamente no perfil proteico das formas não tratadas e 63 spots nas formas tratadas, com um acúmulo diferencial de 29 spots. Dentre as proteínas diferencialmente acumuladas, o Fator de Iniciação Traducional (IF-2), importante na síntese proteica, apresentou-se reduzido sob efeito do PS-UA. Na ontologia gênica para regulação de processos biológicos, verificou-se que o PS-UA exerceu considerável influência com relação à expressão de proteínas. O PS-UA foi eficaz contra as formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi sem causar toxicidade às células de mamíferos, destacando-se como uma nova proposta de fármacos leishmanicidas.Leishmaniasis is as a serious public health problem in many countries of the world, affecting socially and economically vulnerable populations. The search for new phytochemicals with antiparasitic action, lower toxicity and low cost appears as an alternative to existing treatments. Some studies have shown that usnic acid (AU) has several biological activities (antiproliferative, antiviral, anti-inflammatory, antimicrobial and antiparasitic), however it presents high hepatotoxicity and low solubility. The soluble form of AU, potassium salt derived from single acid (PS-UA) or potassium usnate, has been used by some researchers to increase its efficacy and reduce its toxicity. The objective of this study was to analyze the in vitro leishmanicidal activity of AU and PS-UA against Leishmania (Leishmania) infantum chagasi promastigotes and macrophage cytotoxicity (RAW 264.7); as well as to evaluate if these compounds interfere in the morphology of the parasites. AU was isolated from the crude lichen extract Cladonia substellata Vainio and the PS-UA was obtained from the salinization of this extract. The antiprotozoal activity of AU and PS-UA against promastigotes of L. (L.) infantum chagasi and cell viability were evaluated by the MTT assay. Structural and ultrastructural analyzes of the parasites were performed by electron microscopy. In addition, two-dimensional gel electrophoresis (2D) and mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) were used to highlight and identify proteins differentially expressed by promastigote forms of the parasites under the action of PS-UA (6,25 μg/mL). The IC50 of AU and PS-UA against L. (L.) infantum chagasi promastigotes were determined (18.30 ± 2.00 and 3.71 ± 2.99 μg/mL, respectively) and the concentration of IC5₅₀ of PS-UA was found to be seven times less toxic to macrophages (CC₅₀ = 26.31 ± 13.55 μg/mL, IS = 7). Analysis of the parasites by scanning electron microscopy revealed surface and shape changes (according to the determined IC₅₀ concentrations). The following ultrastructural changes were observed: under AU action, swelling of the parasites, loss of cell polarity and increase in the number of cytoplasmic vacuoles were detected; already under action of the PS-UA was observed changes in nuclear chromatin, intense cytoplasmic vacuolization, extensive mitochondrial swelling, lipid bodies and electron-dense vesicles throughout the cytoplasm. A total of 450 protein spots were observed through the electrophoresis (2D) and in the comparative analysis of the proteomic profiles between the promastigote forms treated with PS-UA and the untreated forms, 173 spots were revealed, 81 spots found exclusively in the protein profile of untreated forms and 63 spots in the treated forms, with a differential accumulation of 29 spots. Among the differentially accumulated proteins, the Translation initiation factor (IF-2), important in the protein synthesis, was reduced under the effect of PSUA. In the gene ontology for regulation of biological processes, it was verified that the PS-UA exerted considerable influence with respect to the expression of proteins. The PS-UA was effective against the promastigote forms of L. (L.) infantum chagasi without causing toxicity to mammalian cells, standing out as a new proposal of leishmanicidal drugs.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em Inovacao TerapeuticaUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/embargoedAccessLeishmanioseÁcido úsnicoToxicidadeAnálise comparativa da atividade leishmanicida in vitro do ácido úsnico e do seu derivado usnato de potássio isolado da Cladonia substellata Vainioinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisdoutoradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPELICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82310https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/35711/3/license.txtbd573a5ca8288eb7272482765f819534MD53ORIGINALTESE João Soares Brito da Luz.pdfTESE João Soares Brito da Luz.pdfapplication/pdf7046865https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/35711/1/TESE%20Jo%c3%a3o%20Soares%20Brito%20da%20Luz.pdf12b4a1a7519d2ad558a0e28bc853883fMD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; 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