Desenvolvimento e validação de método de amplificação isotérmica para detecção de leptospiras patogênicas
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Data de Publicação: | 2020 |
Tipo de documento: | Dissertação |
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Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPel - Guaiaca |
Texto Completo: | http://guaiaca.ufpel.edu.br/handle/prefix/8852 |
Resumo: | A leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira que afeta tanto humanos quanto animais. Devido à semelhança dos sinais clínicos com outras doenças febris, o diagnóstico torna-se um desafio. Os métodos de diagnóstico diretos e indiretos atualmente utilizados são a cultura bacteriana e os testes sorológicos, respectivamente. Esses, por sua vez, apresentam uma série de desvantagens como por exemplo, o tempo de realização e a detecção indireta da bactéria através de anticorpos. Nesse contexto, faz-se necessária a busca de novas alternativas para o diagnóstico da leptospirose. Embora existam testes moleculares, como o PCR, os quais são bastante eficientes e sensíveis, os mesmos necessitam de equipamentos sofisticados para sua realização, o que não torna seu uso viável em países subdesenvolvidos. O objetivo desse estudo foi desenvolver testes de amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) para três diferentes genes alvo (LIC13162, LIC20239 e lipL32) a fim de detectar leptospiras patogênicas. Construções de primers foram realizadas para as sequências, e testadas em diferentes tempos e concentrações de enzima. O desempenho analítico foi avaliado com base em curva de diluição de cultivo puro de Leptospira, com análise estatística PROBIT e DNA de diversas espécies bacterianas. A performance diagnóstica foi realizada com 63 amostras (44 negativas e 19 positivas) de tecido renal de hamsters. Ambas as análises tiveram seus resultados comparados ao PCR em tempo real. Os testes LAMP para LIC13162 e LIC20239 não obtiveram implementação LAMP de sucesso. Entretanto, demonstraram estar presentes apenas em leptospiras patogênicas pelo PCR. O LAMP lipL32 foi padronizado em 30 min de reação e 4 U de enzima. Seu limite de detecção foi de 156 células/ml, apresentando mesmo valor que o qPCR. A sensibilidade analítica do qPCR foi de 16,5 células/µl (probit 0,5) e 282 células/µl (probit 0,95). Já a sensibilidade analítica do LAMP foi de 25,7 células/µl (probit 0,5) e 562 células/µl (probit 0,95). A performance diagnóstica do LAMP lipL32 foi de 84,2% de sensibilidade e especificidade de 93,2%. Os resultados obtidos demonstraram a identificação de dois novos genes de leptospiras patogênicas até então não descritos na literatura, bem como a reafirmação do alvo lipL32 como excelente alvo para diagnóstico de leptospirose. |
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2022-12-27T21:50:50Z2022-12-272022-12-27T21:50:50Z2020-02-17PACCE, Violetta. Desenvolvimento e validação de método de amplificação isotérmica para detecção de leptospiras patogênicas. 2020. 66f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2020.http://guaiaca.ufpel.edu.br/handle/prefix/8852A leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira que afeta tanto humanos quanto animais. Devido à semelhança dos sinais clínicos com outras doenças febris, o diagnóstico torna-se um desafio. Os métodos de diagnóstico diretos e indiretos atualmente utilizados são a cultura bacteriana e os testes sorológicos, respectivamente. Esses, por sua vez, apresentam uma série de desvantagens como por exemplo, o tempo de realização e a detecção indireta da bactéria através de anticorpos. Nesse contexto, faz-se necessária a busca de novas alternativas para o diagnóstico da leptospirose. Embora existam testes moleculares, como o PCR, os quais são bastante eficientes e sensíveis, os mesmos necessitam de equipamentos sofisticados para sua realização, o que não torna seu uso viável em países subdesenvolvidos. O objetivo desse estudo foi desenvolver testes de amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) para três diferentes genes alvo (LIC13162, LIC20239 e lipL32) a fim de detectar leptospiras patogênicas. Construções de primers foram realizadas para as sequências, e testadas em diferentes tempos e concentrações de enzima. O desempenho analítico foi avaliado com base em curva de diluição de cultivo puro de Leptospira, com análise estatística PROBIT e DNA de diversas espécies bacterianas. A performance diagnóstica foi realizada com 63 amostras (44 negativas e 19 positivas) de tecido renal de hamsters. Ambas as análises tiveram seus resultados comparados ao PCR em tempo real. Os testes LAMP para LIC13162 e LIC20239 não obtiveram implementação LAMP de sucesso. Entretanto, demonstraram estar presentes apenas em leptospiras patogênicas pelo PCR. O LAMP lipL32 foi padronizado em 30 min de reação e 4 U de enzima. Seu limite de detecção foi de 156 células/ml, apresentando mesmo valor que o qPCR. A sensibilidade analítica do qPCR foi de 16,5 células/µl (probit 0,5) e 282 células/µl (probit 0,95). Já a sensibilidade analítica do LAMP foi de 25,7 células/µl (probit 0,5) e 562 células/µl (probit 0,95). A performance diagnóstica do LAMP lipL32 foi de 84,2% de sensibilidade e especificidade de 93,2%. Os resultados obtidos demonstraram a identificação de dois novos genes de leptospiras patogênicas até então não descritos na literatura, bem como a reafirmação do alvo lipL32 como excelente alvo para diagnóstico de leptospirose.Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic species of the genus Leptospira, which affects both humans and animals. Due to similarity of clinical signs with other febrile diseases, the diagnosis is a challenge. The current direct and indirect methods are bacterial culture and sorological tests. These, on the other hand, presents a variety of disadvantages such as, time-consuming technique and indirect detection of the bacteria by antibodies. So, it is necessary to search for alternative methods for diagnosing leptospirosis. Although there are molecular tests, as PCR, which are efficient and sensitive, they require sophisticated equipment, making its use not viable in underdeveloped countries. The aim of this work was to develop loop-mediated isothermal amplification (LAMP) tests for three different gene targets (LIC13162, LIC20239 and lipL32) in order to detect pathogenic leptospira. Primer constructions were made to the three sequences, and tested for different time and enzyme concentration. Analytic performance was evaluated through dilution curve of pure culture of Leptospira, with a PROBIT statistical analyses and DNA of various bacteria species. Diagnostic performance was done with 63 (44 negative and 19 positive) samples of hamster renal tissue. Both analyses had their results compared to real-time PCR. LAMP tests for LIC13162 and LIC20239 could not be implemented successfully. However, both showed to be present only in pathogenic leptospira by PCR. The lipL32 LAMP was standardized in a 30min reaction and with 4 U of enzyme. Its limit of detection was 156 cells/ml, showing the same numeric value of qPCR. Analytic sensibility of qPCR was 16,5 cells/µl (probit 0,5) and e 282 cells/µl (probit 0,95). For the LAMP test, these values were 25,7 cells/µl (probit 0,5) e 562 cells/µl (probit 0,95). Diagnostic performance of lipL32 LAMP was 84,2% sensitivity and 93,2% specificity. Results showed the identification of two novel genes of pathogenic leptospira that were not yet described in literature, and also the reassurance of lipL32 as an excellent target gene for diagnosing leptospirosis.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESporUniversidade Federal de PelotasPrograma de Pós-Graduação em BiotecnologiaUFPelBrasilCentro de Desenvolvimento TecnológicoCNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIALeptospiraDiagnósticoLAMPDiagnosisDesenvolvimento e validação de método de amplificação isotérmica para detecção de leptospiras patogênicasDevelopment and validation of an isothermal amplification method to detect pathogenic leptospirainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://lattes.cnpq.br/9913020690775567http://lattes.cnpq.br/4649853685495071Lunge, Vagner Ricardohttp://lattes.cnpq.br/4733837875034828Dellagostin, Odir AntônioPacce, Violetta DiasPACCE, Violetta. Desenvolvimento e validação de método de amplificação isotérmica para detecção de leptospiras patogênicas. 2020. 66f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2020.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFPel - Guaiacainstname:Universidade Federal de Pelotas (UFPEL)instacron:UFPELTEXTDissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdf.txtDissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdf.txtExtracted texttext/plain139244http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/bitstream/prefix/8852/6/Dissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdf.txtebb438218981e0d96da36b28ec0b77d3MD56open accessTHUMBNAILDissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdf.jpgDissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1348http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/bitstream/prefix/8852/7/Dissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdf.jpgea33ca289cc282fe76f595c97cd37144MD57open accessORIGINALDissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdfDissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdfapplication/pdf1261210http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/bitstream/prefix/8852/1/Dissertacao_Violetta_Dias_Pacce.pdf64c01cda83d50b8d5de1a77bafc3f1d5MD51open accessCC-LICENSElicense_urllicense_urltext/plain; charset=utf-849http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/bitstream/prefix/8852/2/license_url4afdbb8c545fd630ea7db775da747b2fMD52open accesslicense_textlicense_texttext/html; charset=utf-80http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/bitstream/prefix/8852/3/license_textd41d8cd98f00b204e9800998ecf8427eMD53open accesslicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-80http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/bitstream/prefix/8852/4/license_rdfd41d8cd98f00b204e9800998ecf8427eMD54open accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81866http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/bitstream/prefix/8852/5/license.txt43cd690d6a359e86c1fe3d5b7cba0c9bMD55open accessprefix/88522023-07-13 06:36:21.323open accessoai:guaiaca.ufpel.edu.br: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ório InstitucionalPUBhttp://repositorio.ufpel.edu.br/oai/requestrippel@ufpel.edu.br || repositorio@ufpel.edu.br || aline.batista@ufpel.edu.bropendoar:2023-07-13T09:36:21Repositório Institucional da UFPel - Guaiaca - Universidade Federal de Pelotas (UFPEL)false |
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