Desenvolvimento e validação de método de amplificação isotérmica para detecção de leptospiras patogênicas

• Autor(a) principal: Pacce, Violetta Dias
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFPel - Guaiaca
• Texto Completo: http://guaiaca.ufpel.edu.br/handle/prefix/8852
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA; Leptospira; Diagnóstico; LAMP; Diagnosis

A leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira que afeta tanto humanos quanto animais. Devido à semelhança dos sinais clínicos com outras doenças febris, o diagnóstico torna-se um desafio. Os métodos de diagnóstico diretos e indiretos atualmente utilizados são a cultura bacteriana e os testes sorológicos, respectivamente. Esses, por sua vez, apresentam uma série de desvantagens como por exemplo, o tempo de realização e a detecção indireta da bactéria através de anticorpos. Nesse contexto, faz-se necessária a busca de novas alternativas para o diagnóstico da leptospirose. Embora existam testes moleculares, como o PCR, os quais são bastante eficientes e sensíveis, os mesmos necessitam de equipamentos sofisticados para sua realização, o que não torna seu uso viável em países subdesenvolvidos. O objetivo desse estudo foi desenvolver testes de amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) para três diferentes genes alvo (LIC13162, LIC20239 e lipL32) a fim de detectar leptospiras patogênicas. Construções de primers foram realizadas para as sequências, e testadas em diferentes tempos e concentrações de enzima. O desempenho analítico foi avaliado com base em curva de diluição de cultivo puro de Leptospira, com análise estatística PROBIT e DNA de diversas espécies bacterianas. A performance diagnóstica foi realizada com 63 amostras (44 negativas e 19 positivas) de tecido renal de hamsters. Ambas as análises tiveram seus resultados comparados ao PCR em tempo real. Os testes LAMP para LIC13162 e LIC20239 não obtiveram implementação LAMP de sucesso. Entretanto, demonstraram estar presentes apenas em leptospiras patogênicas pelo PCR. O LAMP lipL32 foi padronizado em 30 min de reação e 4 U de enzima. Seu limite de detecção foi de 156 células/ml, apresentando mesmo valor que o qPCR. A sensibilidade analítica do qPCR foi de 16,5 células/µl (probit 0,5) e 282 células/µl (probit 0,95). Já a sensibilidade analítica do LAMP foi de 25,7 células/µl (probit 0,5) e 562 células/µl (probit 0,95). A performance diagnóstica do LAMP lipL32 foi de 84,2% de sensibilidade e especificidade de 93,2%. Os resultados obtidos demonstraram a identificação de dois novos genes de leptospiras patogênicas até então não descritos na literatura, bem como a reafirmação do alvo lipL32 como excelente alvo para diagnóstico de leptospirose.