Proliferação de células musculares lisas por QSOX1 extracelular ativa e inativa

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Prado, Maiara Lazaretti Rodrigues do
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1884/41872
Resumo: Orientadora : Profª Drª Lia Sumie Nakao
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spelling Prado, Maiara Lazaretti Rodrigues doBorges, Beatriz EssenfelderUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia BásicaNakao, Lia Sumie2016-03-28T14:41:25Z2016-03-28T14:41:25Z2016http://hdl.handle.net/1884/41872Orientadora : Profª Drª Lia Sumie NakaoCo-orientadora : Drª Beatriz Essenfelder BorgesDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 22/01/2016Inclui referências : f. 60-65Área de concentraçãoResumo: Quiescina/sulfidril oxidase 1 (QSOX1) são flavoenzimas com atividade tiol oxidase, capazes de oxidar tiois a dissulfeto reduzindo o oxigênio molecular a peróxido de hidrogênio. A QSOX1b foi detectada em sobrenadantes de células musculares lisas e células progenitoras de músculo liso em abordagens proteômicas. Os estudos com células musculares lisas vasculares (VSMC), mostraram que a QSOX1b induz um aumento na proliferação e na migração destas células, através de processos independente e dependente da atividade sulfidril oxidase, respectivamente. Entretanto, o mecanismo molecular que transduz o sinal mitogênico disparado pela QSOX1 extracelular não foi investigado. O objetivo desse trabalho foi estudar a proliferação de VSMC estimulada pela QSOX1b recombinante ou secretada por célula eucariótica (HEK 293T) super-expressando QSOX1. Foi comprovado o efeito proliferativo das QSOX1b recombinantes selvagem e mutada (75 e 100 nM) em VSMC em relação ao controle negativo, utilizando o ensaio de cristal violeta e pela contagem direta na câmara de Neubauer. Os meios condicionados de HEK 293T superexpressando QSOX1b selvagem e mutada também induziram a proliferação de VSMC. A inibição de NADPH oxidase por difenilenioiodônio (DPI), assim como a pré-incubação das células com Peg-Sod, diminuiu significativamente a proliferação de VSMC, indicando a participação do radical superóxido produzido por Nox. Dados prévios nossos mostravam que a pré-incubação com Peg-Cat não alterava a taxa proliferativa. Nós confirmamos estes dados, o quais sugerem que as QSOX1b estimulam a proliferação de uma forma pouco usual. A pré-incubação de VSMC com um inibidor da via de Ras (FPTIII) levou a uma diminuição da proliferação de VSMC induzida pela QSOX1b de forma significante. Finalmente, a incubação das VSMC com ambas as formas da QSOX1b recombinantes por 10 e 30 minutos estimularam a fosforilação de tirosinas e de treonina, evidenciado por western blotting. Os resultados obtidos confirmam que as QSOX1b selvagem e mutada induzem a proliferação de VSMC de forma dependente e independente da atividade enzimatica. Além disso, superóxido, gerado pela NADPH oxidase, a proteína Ras e a fosforilação de tirosinas e treoninas parecem estar associados com a proliferação induzida pela QSOX1b. Palavras-chave: Quiescina sulfidril oxidase; célula muscular lisa vascular; proliferação celular, superóxido, Ras.Abstract: Quiescin-Sulfhydryl Oxidase 1 (QSOX1) are flavoenzymes with thiol oxidase activity that are able to oxidize thiols to disulfide, through reduction of molecular oxygen to hydrogen peroxide. QSOX1 was detected in the supernatant of smooth muscle cells and smooth muscle progenitor cells though proteomics approaches. Studies using vascular smooth muscle cells (VSMC) have shown that QSOX1b induces an increase both in proliferation and migration of these cells, through processes independent and dependent of the sulfhydryl oxidase activity, respectively. However, the molecular mechanism which transduces the mitogenic signal that is triggered by extracellular QSOX1 was not investigated. The aim of this project was to study the VSMC proliferation stimulated by recombinant QSOX1 or secreted protein by eukaryotic cell (HEK 293T) super expressing QOSX1. The proliferative effect of recombinant QSOX1b, both wild type and mutated (75 and 100 nM), was confirmed related to the negative control, through crystal violet assay and direct counting with Neubauer chamber. The conditioned media of HEK 293T super expressing QSOX1b both wild type and mutated also induced the VSMC proliferation. The inhibition of NPDPH oxidase by diphenyleneiodonium (DPI), as well as pre-incubation of the cells in Peg-Sod have significantly reduced the proliferation of VSMC, which indicates the participation of the superoxide radical produced by Nox. Previous data have shown that the pre-incubation in Peg-Cat was not able to alter the proliferative rate. We have confirmed these data, which suggest that QSOX1b stimulates the cell proliferation in an unusual manner. The pre-incubation of VSMC in a Ras pathway inhibitor (FTPIII) led to a significantly decrease in VSMC proliferation induced by QSOX1b. At last, the incubation of VSMC in recombinant forms of QSOX1b for 10 and 30 minutes have stimulated the phosphorylation of tyrosine and threonine, evidenced by western blot assay. The obtained results confirm that QSOX1b both wild type and mutated induce the proliferation of VSMC in an enzymatic activity dependent and independent way. Furthermore, the superoxide produced by NADPH oxidase, Ras protein, and the phosphorylation of tyrosine and threonine seem to be associated with the cell proliferation induced by QSOX1b. Keywords: Quiescin-sulfhydryl oxidase; vascular smooth muscle cell; cell proliferation; superoxide; Ras.66 f. : il. algumas color.application/pdfDisponível também em formato digitalMicrobiologiaParasitologiaProliferação celularSuperóxidosProliferação de células musculares lisas por QSOX1 extracelular ativa e inativainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - MAIARA LAZARETTI RODRIGUES DO PRADO.pdfapplication/pdf1942469https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41872/1/R%20-%20D%20-%20MAIARA%20LAZARETTI%20RODRIGUES%20DO%20PRADO.pdf6c14a04f9194c2621d23eaef831f3580MD51open accessTEXTR - D - MAIARA LAZARETTI RODRIGUES DO PRADO.pdf.txtExtracted Texttext/plain93399https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41872/2/R%20-%20D%20-%20MAIARA%20LAZARETTI%20RODRIGUES%20DO%20PRADO.pdf.txta6a4b2e1f3dbc752c9aa85ef9765886cMD52open accessTHUMBNAILR - D - MAIARA LAZARETTI RODRIGUES DO PRADO.pdf.jpgR - D - MAIARA LAZARETTI RODRIGUES DO PRADO.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1142https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41872/3/R%20-%20D%20-%20MAIARA%20LAZARETTI%20RODRIGUES%20DO%20PRADO.pdf.jpgf5e72796a66357b66abf0f905a4398f8MD53open access1884/418722016-04-08 04:01:00.64open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/41872Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082016-04-08T07:01Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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