Caracterização das novas subfamílias de amastinas e desenvolvimento de tecnologia para geração de nocautes condicionais em Trypanosoma cruzi

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Marcolino, Monica Mendes Kangussu
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1884/36077
Resumo: Orientador : Dr. Wanderson Duarte da Rocha
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spelling Marcolino, Monica Mendes KangussuUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Rocha, Wanderson Duarte da2018-04-18T19:42:51Z2018-04-18T19:42:51Z2014http://hdl.handle.net/1884/36077Orientador : Dr. Wanderson Duarte da RochaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 23/04/2014Inclui referênciasResumo: O protozoário Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, é um parasita intracelular obrigatório. Logo, o melhor entendimento da função de proteínas envolvidas diretamente na interação parasito::hospedeiro poderá fornecer informações chaves no desenvolvimento de fármacos mais eficientes. As amastinas, inicialmente descritas como uma família de glicoproteínas de membrana mais expressas em formas amastigotas, apresentam alta variabilidade podendo ser estratificada em quatro subfamílias. Contudo, pouco se sabe sobre a função destas proteínas, já que estudos de genômica funcional em T. cruzi são limitados devido às poucas opções de ferramentas de manipulação da expressão. Neste contexto, uma boa opção seria o uso do sistema DiCre, que permite a deleção de longas regiões genômicas ou de marcas de seleção por recombinação sítio específica mediada pela recombinase Cre, cuja atividade é regulada pelo ligante rapamicina. Desta forma, este trabalho tem por objetivo a caracterização funcional das novas subfamílias de amastinas de T. cruzi por métodos convencionais, além da transferência de um sistema de nocaute condicional mediada pela recombinase DiCre. Como principais resultados, temos a reclassificação das amastinas de T. cruzi em d-, d-Ama40, ß1- e ß2-amastinas, sendo que as d-amastinas possuem maior número de cópias (~14) e em múltiplos cromossomos no genoma. Para várias cepas testadas, a expressão de mRNA das d-amastinas e d-Ama40 é maior em amastigotas, enquanto que as ß- amastinas em epimastigotas. Apesar de todas as amastinas estarem associadas a frações de membrana, elas parecem estar localizadas em compartimentos distintos, com alguma provável sobreposição. Paralelamente a estes esforços foram gerados vetores para utilização do sistema de nocautes condicionais utilizando DiCre em T. cruzi e sua atividade foi testada. Dados de Southern blot sugerem que a recombinação ocorreu de forma controlada após longo período de exposição ao ligante. Sendo assim, esta ferramenta poderá ser utilizada para a remoção de marcas de seleção, e excisão de longos trechos de DNA. Esta reduzida atividade de DiCre pode ser considerada positiva, uma vez que a expressão não regulada da recombinase CRE tem se mostrado tóxica diversos organismos.Abstract: Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, is an obligate intracellular parasite. Therefore, the understanding of protein function directly involved in host-parasite interaction might bring key information for new strategies of drug development. Amastins, initially described as amastigote-specific membrane glycoprotein family, present high variability allowing its classification into four subfamilies. Nevertheless, little is known regarding the amastin function, once functional genomics studies in T. cruzi are restricted due to the few options available for reverse genetics. In this scenario, one versatile option would be the usage of Di_Cre recombinase system. It is a site-specific recombinase activated by ligand, which catalyzes the recombination between two 34 bp sequences called LoxP permitting the deletion of long stretches of genomic DNA or drug-resistance marks. In this sense, here we aim to characterize the function of new T. cruzi amastin subfamilies by conventional methods beyond the transference of Di_Cre mediated conditional gene knockout system. As leading results, T. cruzi amastins were reclassified into d-, d-Ama40, ß1- e ß2-amastins. d-amastins have greater number of copies (~14) and are present in multiple chromosomes in the genome. Expression of d-amastins and d-Ama40 mRNA is more abundant in amastigote forms, while ß- amastins in epimastigotes. Although all amastins are associate do membrane fraction, they seem to be localized in distinct cell compartments with some overlapping. Alongside, plasmids to the DiCre mediated conditional gene knockout system were built to allow its expression in T. cruzi, and its activity was tested. Southern blot data suggest the recombination occurred in a controlled fashion after the ligand exposure for longer periods. Therefore, this tool may be used to the excision of drug-resistance marks and/or long genomic DNA sequences. The reduced activity of Di_Cre may be considered positive result since Cre recombinase expression has been detected as toxic for several organisms.120f. : il. algumas color., tabs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalTesesTripanossoma cruziProteínasBiologia molecularCaracterização das novas subfamílias de amastinas e desenvolvimento de tecnologia para geração de nocautes condicionais em Trypanosoma cruziinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - MONICA MENDES KANGUSSU MARCOLINO.pdfapplication/pdf8471026https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/36077/1/R%20-%20T%20-%20MONICA%20MENDES%20KANGUSSU%20MARCOLINO.pdf2f430b1727dea8bff58f3f94ba674047MD51open accessTEXTR - T - MONICA MENDES KANGUSSU MARCOLINO.pdf.txtExtracted Texttext/plain349719https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/36077/2/R%20-%20T%20-%20MONICA%20MENDES%20KANGUSSU%20MARCOLINO.pdf.txtcf532f88d4659d277e8b69bfafada568MD52open accessTHUMBNAILR - T - MONICA MENDES KANGUSSU MARCOLINO.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1162https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/36077/3/R%20-%20T%20-%20MONICA%20MENDES%20KANGUSSU%20MARCOLINO.pdf.jpg8b35e51ac44624d7a636b841647258adMD53open access1884/360772018-04-18 16:42:51.257open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/36077Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082018-04-18T19:42:51Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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