Identificação de proteínas envolvidas na exportação de RNA mensageiro do núcleo para o citoplasma em Trypanosoma cruzi : caracterização funcional de TcSub2

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Serpeloni, Mariana
Data de Publicação: 2010
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/24133
Resumo: Orientador : Andréa Rodrigues Ávila
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spelling Hoffman, Federico GuillermoUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularÁvila, Andréa RodriguesSerpeloni, Mariana2022-12-06T19:50:36Z2022-12-06T19:50:36Z2010https://hdl.handle.net/1884/24133Orientador : Andréa Rodrigues ÁvilaCo-orientador : Federico Guillermo HoffmanDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/03/2010Inclui bibliografiaÁrea de concentração : Biologia celular e molecularResumo: Diferentes espécies de RNAs são exportadas do núcleo por vias especializadas em eucariotos. Nos eucariotos superiores a exportação nuclear da maioria das espécies de RNAs, como microRNAs (miRNAs), rRNAs, pequenos RNAs nucleares RNAs (snRNAs) e RNA transportadores (tRNAs), seguem o modelo de transporte via exportinas e RanGTP, onde exportinas específicas estão envolvidas com diferentes vias de exportação. No entanto, a exportação nuclear da maioria dos RNAs mensageiros (mRNAs) não segue a via dependente de RanGTP. A maquinaria de exportação de mRNAs está altamente integrada com o processamento de mRNA e inclui um conjunto específico de adaptadores de transporte, proteínas ligadoras de RNAs (RBPs), RNA helicases e proteínas associadas ao complexo de poro nuclear (NPC). Ainda não se sabe se as vias de exportação de RNAs estão conservadas em eucariotos pertencentes às linhagens basais e a pergunta de como o complexo de exportação de RNAs era no eucarioto ancestral (LECA) ainda permanece em aberto. Um dos nossos objetivos foi reconstruir a história evolutiva de diferentes vias de exportação de RNAs em eucariotos. Para isso, nós investigamos o genoma de eucariotos para a busca de proteínas homólogas envolvidas na exportação de RNAs em metazoários e fungos, utilizando como sementes de busca as proteínas de humanos e fungos funcionalmente aracterizadas. Os resultados da genômica comparativa indicaram que muitas das proteínas-chave envolvidas em diferentes vias de exportação de RNAs dependente de RanGTP estão conservadas em eucariotos basais e então nós inferimos que ortólogos destas proteínas já estavam presentes em LECA. A exportação de mRNA é a mais complexa eu eucariotos e a menos conservada entre essas linhagens basais examinadas neste estudo. Isto sugere que a via de exportação de mRNA em eucariotos basais é diferente do que é observado em eucariotos superiores. Para entender melhor a exportação de mRNAs em linhagens basais de eucariotos, decidimos investigar a função de algumas proteínas altamente conservadas em tripanossomatídeos, agentes causais de doenças humanas fatais. A proteína mais conservada ao longo da filogenia de eucariotos, determinada pela nossa análise, foi Sub2/UAP56, um componente do complexo multiprotéico que conecta transcrição com exportação de mRNA; TREX (Transcription/Export). Ela é uma proteína nuclear em Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi. Análises de imunocitoquímica ultraestrutural mostraram que a proteína Sub2 de T. cruzi (TcSub2) está localizada em sítios dispersos no núcleo, com ausência de marcação no nucléolo, e na interface entre as áreas de cromatina densa e frouxa, indicando a associação com sítios de transcrição. Este resultado foi analisado por ensaios de ncorporação de BrUTP. Observamos que esta proteína colocaliza com sítios de transcrição por RNA Polimerase II, corroborando com os resultados de microscopia eletrônica. Essas evidências sugerem ortemente que TcSub2 participa do metabolismo nuclear de mRNA. Nós estamos atualmente investigando o papel de Sub2 de T. cruzi e T. brucei para elucidar se está de fato relacionada com a exportação de mRNAs em tripanossomatídeos. Além disso, o nocaute duplo do gene de TcSub2 é letal em T. cruzi e ensaios de interferência de RNA (RNAi) do gene TbSub2 altera o crescimento celular de T. brucei, indicando que é uma proteína essencial em ripanossomatídeos, similar em outros eucariotos.Abstract: Different RNA species are exported from the nucleus by specialized pathways in eukaryotes. In "higher" eukaryotes, the nuclear export of most RNA species, such as microRNAs (miRNAs), rRNAs, small uclear RNAs (snRNAs), and transfer RNAs (tRNAs), has been shown to follow the RanGTP-exportin model of transport, and specific exportins are involved with the different export pathways. However, nuclear export of most mRNAs does not follow the RanGTP-exportin pathway. The mRNA export machinery is highly integrated with mRNA processing, and it includes a different set of nuclear transport adaptors plus other mRNA binding proteins, RNA helicases, and nuclear pore complex (NPC) associated proteins. It is not known whether the RNA export pathways are conserved in deeply diverging members of the eukaryotic lineage, and the question of how complex the nucleocytoplasmic export of RNA was in the last eukaryotic common ancestor (LECA) remains open. One of our objectives was to reconstruct the evolutionary history of the different RNA export pathways across eukaryotes. To do so, we screened an array of eukaryotic genomes for the presence of homologs of the proteins involved in RNA export in metazoa and fungi, using human and yeast proteins as queries. Results from our genomic comparisons indicate that several of the key proteins involved in the different Randependent RNA export pathways are conserved across most eukaryotic lineages, and thus we infer that orthologs of them were highly likely to have been already present in LECA. The mRNA export pathway is the most complex and the least conserved among those xamined in this study, suggesting that mRNA export among deeply diverging eukaryotic lineages is different from what is observed in extant "higher" eukaryotes. To better understand mRNA export in deeply iverging eukaryote lineages, we decided to investigate the function of some well conserved proteins in trypanosomatid protozoa, causative agents of deadly human diseases. The most conserved protein across all eukaryotes as determined by our analysis was Sub2/UAP56, a component of the multiprotein complex that connects transcription with mRNA export, TREX (Transcription/Export). It is a nuclear protein in Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi. Ultrastructural immunocytochemistry an lysis showed that T. cruzi Sub2 is localized in dispersed foci all over the nuclei, excluding nucleolus, and at the interface between dense and non-dense chromatin areas indicating its association to transcription sites. This result was further analyzed by BrUTP incorporation assays. We observed that this protein is co-localized with RNA pol II transcription sites corroborating our results. Taken together, these evidences strongly suggest that TcSub2 participates in nuclear mRNA metabolism. We are currently investigating the role of T. cruzi and T. brucei Sub2 to elucidate if they are in fact components of mRNA export in trypanosomatids. Besides, the double knockout of the TcSub2 gene is lethal in T. cruzi and RNA interference assays (RNAi) of TbSub2 causes a growth defect in T. brucei, indicating that it is an essential protein for trypanosomes, similar to other eukaryotes.139 f. : il., grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalTesesTripanossomoÁcido ribonucleicoCitologia e biologia celularBiologia molecularIdentificação de proteínas envolvidas na exportação de RNA mensageiro do núcleo para o citoplasma em Trypanosoma cruzi : caracterização funcional de TcSub2info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALDissertacao - Mariana Serpeloni_FINAL.pdfapplication/pdf4659016https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/24133/1/Dissertacao%20-%20Mariana%20Serpeloni_FINAL.pdfb882a2815f7e4ed1ef46787640d2dbf5MD51open accessTEXTDissertacao - Mariana Serpeloni_FINAL.pdf.txtExtracted Texttext/plain294667https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/24133/2/Dissertacao%20-%20Mariana%20Serpeloni_FINAL.pdf.txt5a34f1d0b351eba50ac1cbcca4247db8MD52open accessTHUMBNAILDissertacao - Mariana Serpeloni_FINAL.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1351https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/24133/3/Dissertacao%20-%20Mariana%20Serpeloni_FINAL.pdf.jpg439ec20d048756d98d6dd9ccef242a87MD53open access1884/241332022-12-06 16:50:36.725open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/24133Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082022-12-06T19:50:36Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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