Oxidação do "pool" de nucleotídeos em células de melanoma murino (B16-F-10) induzida por oxigênio molecular singlete e melanogênese
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
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| Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPR |
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Silva, Juliana de Carvalho, 1994-Cunha, Elizabeth Sousa da, 1982-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Martinez, Glaucia Regina2022-03-23T21:30:53Z2022-03-23T21:30:53Z2019https://hdl.handle.net/1884/73840Orientadora: Profa. Dra. Glaucia Regina MartinezCoorientadora: Dra. Elizabeth Sousa da CunhaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 27/09/2019Inclui referências: p. 63-71Resumo: O melanoma é o tipo de câncer de pele mais agressivo que tem origem nos melanócitos, as células produtoras do pigmento melanina. A radiação UV tem sido considerada um importante agente etiológico da doença. Neste contexto, a melanina desempenha um papel fotoprotetor, devido sua capacidade de absorver a luz UVB. Entretanto, ela também pode atuar como fotossensibilizador sob radiação UVA e luz visível, contribuindo para a geração de espécies reativas de oxigênio, principalmente oxigênio molecular singlete (1O2), que é formado por transferência de energia de excitação para o O2 no estado fundamental triplete, e é a forma mais reativa do oxigênio molecular capaz de oxidar biomoléculas. No DNA, 1O2 reage exclusivamente com a base guanina, formando 8-oxoguanina que pode parear com as bases citosina e adenina, e então a transversão G.C para T.A é induzida. A guanina também pode ser oxidada no pool de desoxinucleotídeos celular formando 8-oxo-dGTP, um potente substrato mutagênico para a síntese de DNA, e neste caso, ambas as transversões seriam induzidas: A.T para C.G e G.C para T.A. A enzima 8-oxo-dGTPase, produto do gene humano MTH1, impede a incorporação de 8-oxo-dGTP no DNA. 8-oxodGTPase hidrolisa 8-oxo-dGTP a 8-oxo-dGMP, que não pode ser refosforilada, e pela ação da 8-oxo-dGMPase é ainda degradada a 8-oxo-dG, que é excretada para o meio extracelular. O objetivo deste estudo foi avaliar a oxidação de dGTP em células de melanoma murino (B16-F10), causada por 1O2 e/ou melanogênese estimulada. Para gerar 1O2 pelo processo de fotossensibilização do tipo II, as células B16-F10 foram previamente incubadas com 10 Mig/mL de Rosa Bengala Acetato (RBAc) e posteriormente irradiadas com luz visível verde (526 ± 20 nm), e o estímulo da melanogênese foi realizado utilizando meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 0,4 mM de L-tirosina e 10 mM de NH4Cl. As células foram submetidas a condições de claro (irradiadas) e escuro, e as amostras coletadas em 0h e 18h. Então, foram realizadas análises de determinação intra e extracelular de 8-oxo-dG por HPLCMS/ MS, bem como atividade e expressão das enzimas de sanitização, por HPLC-PDA e RT-qPCR, respectivamente. Foi demonstrado que os níveis de 8-oxo-dG excretados das células foram elevados 18 h após a realização dos tratamentos, em comparação ao tempo de 0 h e à quantidade de 8-oxo-dG intracelular. A única alteração observada se refere à ação do RBAc nas células sem estímulo da melanogênese, nas quais promoveu uma retenção da 8-oxo-dG no meio intracelular. Também foi demonstrado que a atividade das enzimas 8-oxo-dGTPase e 8-oxo-dGMPase não sofreram modulação significativamente estatística, bem como a expressão do gene MTH1. Sendo assim, 1O2 e o estímulo da produção de melanina não promoveram alterações no sistema de sanitização e por consequência não se observaram alterações correspondentes nos níveis de produtos de oxidação do pool de nucleotídeos secretados pelas células.Abstract: Melanoma is the most aggressive type of skin cancer that originates in melanocytes, the melanin pigment-producing cells. UV radiation has been considered an important etiological agent of the disease. In this context, melanin plays a photoprotective role, due to its ability to absorb UVB light. However, it can also act as photosensitizer under UVA radiation and visible light, contributing to the generation of reactive oxygen species, mainly singlet molecular oxygen (1O2) that is formed by the transference of excitation energy to the O2 in the triplet ground state, and it is the most reactive form of O2, capable of oxidizing biomolecules. In DNA, the 1O2 reacts exclusively with the guanine base, forming 8-oxoguanine that can pair with cytosine and adenine bases, generating G.C to T.A transversion. Guanine can also be oxidized in the cellular deoxynucleotide pool forming 8-oxo-dGTP, a potent mutagenic substrate for DNA synthesis and in this case both transversions would be induced: A.T for C.G and G.C for T.A. The 8-oxodGTPase enzyme, a product of the human MTH1 gene, prevents the incorporation of 8-oxodGTP into the DNA. The 8-oxodGTPase hydrolyzes 8-oxodGTP to 8-oxodGMP, which cannot be rephosphorylated, and by the action of the 8-oxodGMPase it is further degraded to 8-oxodG and excreted to the extracellular medium. The objective of this study was to evaluate the deoxynucleotides pool oxidation in murine melanoma cells (B16-F10) caused by 1O2 and/or stimulated melanogenesis. To generate 1O2 by the type II photosensitization process, B16-F10 cells were previously incubated with 10 Mig/mL Rose Bengal Acetate (RBAc) and posteriorly irradiated with green visible light (526 ± 20 nm), and the melanogenesis stimulation was performed using RPMI 1640 culture medium supplemented with 0.4 mM L-tyrosine and 10 mM NH4Cl. The cells were submitted to light (irradiated) and dark conditions, and the samples collected at 0h and 18h. Then, intra and extracellular determination analyzes of 8-oxo-dG were performed by HPLC-MS/MS, as well as activity and expression of sanitizing enzymes by HPLC-PDA and RT-qPCR, respectively. The excreted 8-oxo-dG levels of the cells were shown to be elevated 18 h after testing, compared to the time of 0 h and the amount of intracellular 8-oxo-dG. A single observed change refers to the action of RBAc in cells without melanogenesis stimulation, in which it promotes a retention of 8-oxo-dG in the intracellular environment. It has also been shown that the activity of 8-oxo-dGTPase and 8-oxodGMPase enzymes did not undergo significantly statistical modulation, as well as an expression of the MTH1 gene. Thus, 1O2 and the stimulation of melanin production do not promote alterations in the sanitization system and consequently do not corresponding changes were observed in the levels of oxidation products of the nucleotide pool secreted by the cells.1 arquivo (63 p.) : il. 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