Controle da atividade da enzima regulatória dinitrogenase redutase ADP - ribosiltransferase (DraT) pela proteína GLnB de Azospirillum brasilense
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Data de Publicação: | 2013 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPR |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/1884/29678 |
Resumo: | Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é catalisada pelo complexo enzimático nitrogenase. Este complexo contém duas metaloproteínas: as proteínas Fe e MoFe e sofre modificação pós-traducional. Em Azospirillum brasilense, objeto deste estudo, a regulação pós-traducional envolve a modificação covalente de uma das subunidades da proteína Fe por ADP-ribosilação. Esta ADP-ribosilação inativa reversivelmente a proteína Fe e é catalisada pela DraT em resposta ao aumento de íons amônio ou depleção da energia celular. O grupo ADP-ribosil é removido pela DraG, promovendo reativação da proteína Fe e consequentemente, da nitrogenase. Além das proteínas DraT e DraG, as proteínas PII estão diretamente envolvidas neste processo de desligamento da nitrogenase. Neste trabalho são apresentados resultados referentes ao controle de DraT exercido pelas proteínas PII. Um protocolo alternativo para a purificação de PII nativas foi desenvolvido com a utilização de um tratamente térmico (80°C/15 min) anterior a injeção na coluna. Este tratamento térmico melhorou a homogeneidade da GlnB de A. brasilense de 70 para 99%. A alta estabilidade térmica foi uma característica comum de proteínas PII de várias Proteobactérias. Os valores de Tm utilizando Sypro Orange foram maiores do que 77°C. Experimentos 1H RMN mostraram que a GlnB de A. brasilense foi estável até 70°C. Além disso, experimentos 1H-15N TROSY confirmaram que as amostras de GlnB obtidas com e sem a etapa de tratamento térmico mantiveram a mesma conformação global. A partir destes resultados, o protocolo de purificação de proteínas PII de Proteobactérias foi desenvolvido com a utilização de uma etapa de tratamento térmico de 70°C/15 min anterior a injeção na coluna que promoveu aumento da homogeneidade de 70 para 95%, com maior quantidade de GlnB após cromatografia. Para avaliar o envolvimento de GlnB e GlnZ de A. brasilense na regulação de DraT, a proteína Fe de Azotobacter vinelandii foi utilizada como substrato para atividade in vitro de DraT complexada ou não com as proteínas PII. Nas condições estabelecidas, GlnB foi necessária para a atividade de DraT na presença de Mg-ADP. O efetor de PII 2-oxoglutarato, na presença de Mg-ATP, inibiu a atividade do complexo DraT-GlnB, possivelmente induzindo a dissociação do complexo. A DraT também foi ativada por GlnZ, bem como ambas proteínas uridililadas. Entretanto, uma variante com deleção parcial na volta T não foi capaz de ativar DraT, sugerindo que este seja o sítio de interação entre DraT e GlnB. Estudos cinéticos revelaram que o complexo DraT-GlnB de A. brasilense é, pelo menos, 18 vezes mais eficiente do que DraT purificada de R. rubrum, mas com um valor de Km para NAD+ similar. Finalmente, os resultados mostraram que a ADPribosilação da proteína Fe não afeta o estado eletrônico do seu centro metálico, mas impede a associação da proteína Fe com a MoFe, consequentemente inibindo a transferência de elétrons. |
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Moure, Vivian RotunoUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduaçao em BioquímicaSantos, Marcelo Muller dosHuergo, Luciano FernandesSouza, Emanuel Maltempi de, 1964-2013-08-06T16:07:45Z2013-08-06T16:07:45Z2013-08-06http://hdl.handle.net/1884/29678Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é catalisada pelo complexo enzimático nitrogenase. Este complexo contém duas metaloproteínas: as proteínas Fe e MoFe e sofre modificação pós-traducional. Em Azospirillum brasilense, objeto deste estudo, a regulação pós-traducional envolve a modificação covalente de uma das subunidades da proteína Fe por ADP-ribosilação. Esta ADP-ribosilação inativa reversivelmente a proteína Fe e é catalisada pela DraT em resposta ao aumento de íons amônio ou depleção da energia celular. O grupo ADP-ribosil é removido pela DraG, promovendo reativação da proteína Fe e consequentemente, da nitrogenase. Além das proteínas DraT e DraG, as proteínas PII estão diretamente envolvidas neste processo de desligamento da nitrogenase. Neste trabalho são apresentados resultados referentes ao controle de DraT exercido pelas proteínas PII. Um protocolo alternativo para a purificação de PII nativas foi desenvolvido com a utilização de um tratamente térmico (80°C/15 min) anterior a injeção na coluna. Este tratamento térmico melhorou a homogeneidade da GlnB de A. brasilense de 70 para 99%. A alta estabilidade térmica foi uma característica comum de proteínas PII de várias Proteobactérias. Os valores de Tm utilizando Sypro Orange foram maiores do que 77°C. Experimentos 1H RMN mostraram que a GlnB de A. brasilense foi estável até 70°C. Além disso, experimentos 1H-15N TROSY confirmaram que as amostras de GlnB obtidas com e sem a etapa de tratamento térmico mantiveram a mesma conformação global. A partir destes resultados, o protocolo de purificação de proteínas PII de Proteobactérias foi desenvolvido com a utilização de uma etapa de tratamento térmico de 70°C/15 min anterior a injeção na coluna que promoveu aumento da homogeneidade de 70 para 95%, com maior quantidade de GlnB após cromatografia. Para avaliar o envolvimento de GlnB e GlnZ de A. brasilense na regulação de DraT, a proteína Fe de Azotobacter vinelandii foi utilizada como substrato para atividade in vitro de DraT complexada ou não com as proteínas PII. Nas condições estabelecidas, GlnB foi necessária para a atividade de DraT na presença de Mg-ADP. O efetor de PII 2-oxoglutarato, na presença de Mg-ATP, inibiu a atividade do complexo DraT-GlnB, possivelmente induzindo a dissociação do complexo. A DraT também foi ativada por GlnZ, bem como ambas proteínas uridililadas. Entretanto, uma variante com deleção parcial na volta T não foi capaz de ativar DraT, sugerindo que este seja o sítio de interação entre DraT e GlnB. Estudos cinéticos revelaram que o complexo DraT-GlnB de A. brasilense é, pelo menos, 18 vezes mais eficiente do que DraT purificada de R. rubrum, mas com um valor de Km para NAD+ similar. Finalmente, os resultados mostraram que a ADPribosilação da proteína Fe não afeta o estado eletrônico do seu centro metálico, mas impede a associação da proteína Fe com a MoFe, consequentemente inibindo a transferência de elétrons.application/pdfTesesAzospirillum brasilienseProteinasControle da atividade da enzima regulatória dinitrogenase redutase ADP - ribosiltransferase (DraT) pela proteína GLnB de Azospirillum brasilenseinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - VIVIAN ROTUNO MOURE.pdfapplication/pdf5023104https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/29678/1/R%20-%20T%20-%20VIVIAN%20ROTUNO%20MOURE.pdf87dcd5e092c42cf458de8d8368caf92cMD51open accessTEXTR - T - VIVIAN ROTUNO MOURE.pdf.txtR - T - VIVIAN ROTUNO MOURE.pdf.txtExtracted Texttext/plain226276https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/29678/2/R%20-%20T%20-%20VIVIAN%20ROTUNO%20MOURE.pdf.txtb3d5c71590b7023823e0d392c4eb5243MD52open accessTHUMBNAILR - T - VIVIAN ROTUNO MOURE.pdf.jpgR - T - VIVIAN ROTUNO MOURE.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1317https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/29678/3/R%20-%20T%20-%20VIVIAN%20ROTUNO%20MOURE.pdf.jpgcffb9daa99e73e1bec3b7ee900c047b9MD53open access1884/296782016-04-13 03:16:26.644open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/29678Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082016-04-13T06:16:26Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false |
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