Estudos da atividade nefrotóxica da toxina dermonecrótica (fosfolipase-D) do veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Kusma, Josiana
Data de Publicação: 2008
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1884/15100
Resumo: Orientador : Silvio Sanches Veiga
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spelling Kusma, JosianaGremski, Waldemiro, 1945-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularVeiga, Silvio Sanches, 1962-2018-04-20T20:11:20Z2018-04-20T20:11:20Z2008http://hdl.handle.net/1884/15100Orientador : Silvio Sanches VeigaCo-orientador : Waldemiro GremskiDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2008Inclui bibliografia e anexosÁrea de concentraçao : Biologia celular e molecularAcidentes provocados pela picada de aranhas marrons (Gênero Loxosceles) estão relacionados com manifestações clínicas, incluindo dermonecrose com espalhamento gravitacional e envolvimento sistêmico que pode incluir insuficiência renal, trombocitopenia e hemólise. No presente trabalho, usando camundongos expostos a um tipo selvagem de fosfolipase – D recombinante (toxina dermonecrótica) e uma isoforma dessa toxina mutada no sítio catalítico, fomos capazes de mostrar que o mecanismo pelo qual o veneno provoca danos renais é dependente da atividade catalítica da enzima. Análises por microscopia óptica de biópsia renal de camundongos tratados com a toxina selvagem dermonecrótica recombinante "LiRecDT1" mostraram alterações morfológicas incluindo edema glomerular, eritrócitos e colapso do Espaço de Bowman, deposição de material protéico dentro do lúmen tubular e edema tubular, mas ausência de nefrotoxicidade para camundongos tratados com a isoforma da toxina mutada. Análises ultraestruturais por microscopia eletrônica de transmissão confirmam a citotoxicidade da toxina selvagem apontando distúrbios na estrutura glomerular em podócitos e no endotélio fenestrado. Alterações nos túbulos incluem deposição de material amorfo, edema do lúmen e um grande acúmulo de corpos multivesiculares bem como de estruturas elétron-densas no interior das células epiteliais. Adicionalmente, análises bioquímicas da urina e do sangue mostraram que a toxina selvagem induziu alterações na função renal como, hematúria e azotemia com elevação de uréia no sangue. Além disso, animais tratados com a fosfolipase – D selvagem tiveram proteinúria evidente, já a toxina mutada causou apenas atividade residual. Diferenças biológicas entre as toxinas recombinantes foram corroboradas através de ensaios de letalidade, que mostraram oligúria e mortalidade dos animais tratados com a toxina selvagem, porém ausência nos animais expostos à toxina mutada. Imunofluorescência com anticorpos que reconhecem a toxina fosfolipase–D foi analisada por microscopia confocal revelando deposição, tanto da toxina do tipo selvagem quanto a mutada, ao longo das estruturas tubulares renais. Por imunoblot utilizando soro hiperimune que reconhece a fosfolipase - D do veneno sobre urina de ratos tratados com as toxinas, nós detectamos sinal positivo na região de 30kDa de animais tratados com toxina do tipo selvagem, mas nenhuma reação positiva na urina de camundongos expostos à toxina mutada. Do mesmo modo, a toxina do tipo selvagem causou alterações morfológicas em células MDCK (epiteliais tubulares), incluindo aparecimento de vacúolos citoplasmáticos, defeito na adesão célula-célula e com o substrato de cultura. Também, tratamento com a toxina selvagem inibiu a viabilidade das células MDCK avaliadas pelo ensaio de captação do corante vital vermelho neutro, enquanto a isoforma mutada não apresentou nenhuma atividade. Assim, com base nos dados atuais, temos definida pela primeira vez na literatura um mecanismo molecular para a nefrotoxicidade causada pelo veneno de Loxosceles intermedia dependente da atividade catalítica da toxina fosfolipase – D.Accidents evoked by the bites of brown spiders (Loxosceles genus) are related to clinical manifestations including skin necrosis with gravitational spreading and systemic involvement that may include renal failure, hemolysis and thrombocytopenia. In the present report, by using mice exposed to recombinant wild-type phospholipase-D (dermonecrotic toxin) and a mutated toxin isoform at the catalytic domain, we were able to show that the mechanism by which the venom induces renal damage is dependent on the catalytic activity of the enzyme. Light microscopy analysis of renal biopsies from recombinant wild-type phospholipasetreated mice showed morphologic alterations including glomerular edema, erythrocytes and collapse of Bowman’s space, deposition of proteinaceus material within the tubular lumen and tubular edema, but absence of nephrotoxicity for mutated toxin-treated animals. Ultrastructural analysis through transmission electron microscopy confirmed wild-type toxin cytotoxicity pointing disorders of glomerular filter structure at foot processes and fenestrated endothelium membrane. Tubule alterations include deposits of amorphous material and edema of tubular lumina and increase in epithelial cytoplasmic multivesicular bodies and electron dense structures. Additionally, biochemical analyses of urine and blood showed that wild-type toxin induced changes in renal function causing hematuria and azotemia with elevation of blood urea. Moreover, wild-type phospholipase-D treatment induced proteinuria, whereas mutated toxin caused only residual activity. Biological differences for recombinant toxins were corroborated through mice lethality experiments, which showed oliguria and animal mortality after wild-type treatments, but an absence of lethality following mutated toxin exposure. Immunofluorescence with antibodies to phospholipase-D toxin and confocal microscopy analysis showed deposition of both wild-type and mutated toxins along the renal tubular structures. Immunoblotting with a hyperimmune antiserum against venom phospholipase on urine from toxins-treated mice, we detected a positive signal at region of 30kDa to animals treated with wild-type toxin, but no reaction on urine of mice exposed to mutated toxin. Similarly, wild-type toxin treatment caused morphological alterations of MDCK cells including appearance of cytoplasmic vacuoles, evoked impaired spreading cells detached from each other and from the culture substratum. Wild-type phospholipase toxin treatment of MDCK cells changed their viability evaluated by Neutral-Red Uptake, while mutated isoform had no activity. Thus, on the basis of the present data, we have defined for the first time at literature a molecular mechanism for Loxosceles venom nephrotoxicity dependent on the catalytic activity of phospholipase-D toxin.x, 104f. : il. algumas color.application/pdfporengporDisponível em formato digitalTesesAranha - VenenoCitologia e biologia celularBiologia molecularEstudos da atividade nefrotóxica da toxina dermonecrótica (fosfolipase-D) do veneno da aranha marrom Loxosceles intermediainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALDissertação Josiana Kusma 2008.pdfapplication/pdf2691982https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/15100/1/Disserta%c3%a7%c3%a3o%20Josiana%20Kusma%202008.pdf92e06269151ccefab12454996c9a718aMD51open accessTEXTDissertação Josiana Kusma 2008.pdf.txtExtracted Texttext/plain177042https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/15100/2/Disserta%c3%a7%c3%a3o%20Josiana%20Kusma%202008.pdf.txtde6dd35b69cfb79bb2c8452ccd7e2cc3MD52open accessTHUMBNAILDissertação Josiana Kusma 2008.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1239https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/15100/3/Disserta%c3%a7%c3%a3o%20Josiana%20Kusma%202008.pdf.jpge4356ec12521fe4212ef771e5aa79211MD53open access1884/151002018-04-20 17:11:20.872open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/15100Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082018-04-20T20:11:20Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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