Avaliação de atividade nefrotóxica das toxinas recombinantes dermonecróticas LiRecDT1 do veneno da aranha-marrom L. intermedia e LgRec1 do veneno de L. gaucho

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Hamasaki, Alessandra Emy
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/41267
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga
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spelling Chaim, Olga MeiriUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularVeiga, Silvio Sanches, 1962-Hamasaki, Alessandra Emy2023-02-23T15:01:29Z2023-02-23T15:01:29Z2015https://hdl.handle.net/1884/41267Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaCoorientadora: Profª. Drª. Olga Meire ChaimDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/03/2015Inclui referências : f. 82-99Resumo: Aranhas do gênero Loxosceles são conhecidas como aranhas-marrons, cuja picada é capaz de induzir envenenamento em humanos, em um quadro conhecido como loxoscelismo, o qual se manifesta em sintomas cutâneos e/ou sistêmicos. Tais sintomas incluem dermonecrose com espalhamento gravitacional decorrente de uma resposta inflamatória exacerbada e envolvimento sistêmico que pode incluir insuficiência renal aguda, trombocitopenia e hemólise, podendo ainda levar a vítima a óbito. Entre as diversas toxinas presentes no veneno, destacam-se as fosfolipases-D, as quais são capazes de sozinhas reproduzir manifestações do veneno total, como por exemplo: dermonecrose, aumento na permeabilidade vascular, intensa resposta inflamatória, hemólise, agregação plaquetária e insuficiência renal aguda. As fosfolipases-D apresentam ação nefrotóxica direta sobre o tecido renal, sendo esse efeito dependente da sua atividade enzimática. Nesse ínterim, sabe-se que citocinas e quimiocinas são importantes mediadores envolvidos na manutenção do processo inflamatório, podendo estimular ou inibir a resposta imune, sendo este sabidamente influenciado por metabólitos de lipídios ou alterações em membranas celulares. Dentro desse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos moleculares e os efeitos biológicos associados ao efeito de fosfolipases-D recombinantes que trouxessem subsídios para a compreensão da atividade nefrotóxica do veneno de aranhas Loxosceles. As toxinas recombinantes LiRecDT1 e LgRec1 foram capazes de induz aumento de mRNA das citocinas inflamatórias IL-1?, IL-6, TNF-? e CXCL1 em células renais humanas (HEK- 293) analisadas por PCR quantitativo em tempo real nas concentrações de 50 ?g/mL e 100 ?g/mL analisadas nos tempos de 6, 12 e 24 horas. Ensaio imunoenzimático (ELISA) demonstrou aumento na expressão de proteínas referentes às citocinas IL-1?, IL-6, TNF-? e CXCL1 após 6 horas de incubação. A exposição da linhagem HEK-293 com as toxinas LiRecDT1 e LgRec1 diminuiu a viabilidade celular avaliada pelo método de captação do corante azul de Tripan. Após 6 horas, a LiRecDT1 reduziu o numero de células viáveis em 8,4% (superior ao valor apresentado pelo veneno de L. intermedia de 6,36%). LgRec1 diminui o numero de células viáveis em 6,54% no tempo de 6 horas e 7,42% após 24 horas. Em ensaio in vivo com ratos Wistar machos demonstrou-se proteinúria, hemoglobinúria e hematúria, bem como aumento na concentração sérica de ureia e creatinina, marcadores de dano renal. Além disso, estudo in vivo com ratos wistar demonstrou que a toxina LiRecDT1 foi capaz de induzir danos renais evidenciados por marcadores de função renal. Dessa forma, nosso estudo caracterizou um perfil de expressão de citocinas pró-inflamatórias frente à exposição de células renais humanas às toxinas dermonecróticas LiRecDT1 e LgRec1. Mais estudos são necessários para melhor entendermos o papel da fosfolipase D no desenvolvimento de insuficiência renal aguda. Palavras-chave: fosfolipase D, nefrotoxicidade, aranha-marrom, inflamaçãoAbstract: Spiders of the genus Loxosceles, known as brown-spiders, whose bite can induce poisoning in humans, in a clinical manifestation known as loxoscelism, which manifests as cutaneous and / or systemic symptoms. These symptoms include dermonecrosis with gravitational spreading due to an exacerbated inflammatory response and systemic involvement may include acute renal failure, thrombocytopenia and hemolysis, and may lead the victim to death. Phospholipases-D are able to cause dermonecrosis, hemolysis, platelet aggregation, acute renal failure, increased vascular permeability and dysregulated inflammatory response. Recent data have shown that phospholipase-D has a direct nephrotoxic action on the renal tissue and this effect is dependent on the catalytic site. Meanwhile, it is known that cytokines and chemokines are important mediators involved in the maintenance of the inflammatory process and may stimulate or inhibit the immune response, which is known to be influenced by lipid metabolites or changes in cell membranes. Recombinant toxins LiRecDT1 e LgRec1 induce increased inflammatory cytokine mRNA of IL-1?, IL-6, TNF-? and CXCL1 in humand embryonic kidney cells (HEK-293) analised by real-time quantitative PCR. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed increased protein expression related to cytokines IL-1?, IL-6, TNF-? and CXCL1 after 6 hours of incubation. The incubation of HEK-293 line with the LiRecDT1 LgRec1 toxins demonstrated decreased cell viability assessed by the uptake of trypan blue method. After 6 hours, LiRecDT1 reduced the number of viable cells in 8.4% (higher than the value presented by L. intermedia venom 6.36%). LgRec1 decreases the number of viable cells in 6.54% at time of 6 hours and 7.42% after 24 hours. In vivo assay with male Wistar rats showed the presence of protein in the urine (proteinuria), hemoglobinuria and hematuria, and an increase in serum urea and creatinine. Furthermore, in vivo study with Wistar rats exposed to LiRecDT1 demonstrated that dermonecrotic toxin induces renal damage evidenced by markers of renal function. Thus, our study featured a expression profile of proinflammatory cytokines from human kidney cells exposed to the dermonecrotic toxins LiRecDT1 and LgRec1. More studies are needed to better understand the role of phospholipase D in the development of acute renal failure. In this context, the aim of this study was to evaluate the molecular mechanisms and biological effects associated with the effect of phospholipase- D to bring subsidies for understanding the nephrotoxic activity of the recombinant toxins and LiRecDT1 LgRec1. Key-words: phospholipase D, nephrotoxicity, brown spider, inflammation99 f. : il. algumas color.application/pdfDisponível em formato digitalCitologia e biologia celularBiologia molecularAranhas - VenenoToxicidadeFosfolipasesInflamaçãoAvaliação de atividade nefrotóxica das toxinas recombinantes dermonecróticas LiRecDT1 do veneno da aranha-marrom L. intermedia e LgRec1 do veneno de L. gauchoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - ALESSANDRA EMY HAMASAKI.pdfapplication/pdf1831397https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41267/1/R%20-%20D%20-%20ALESSANDRA%20EMY%20HAMASAKI.pdfe5deb9f6cc2337b10a1d05fce147efdfMD51open accessTEXTR - D - ALESSANDRA EMY HAMASAKI.pdf.txtExtracted Texttext/plain168929https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41267/2/R%20-%20D%20-%20ALESSANDRA%20EMY%20HAMASAKI.pdf.txt9961742d8e3c8d730bd7f0035fed353fMD52open accessTHUMBNAILR - D - ALESSANDRA EMY HAMASAKI.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1148https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41267/3/R%20-%20D%20-%20ALESSANDRA%20EMY%20HAMASAKI.pdf.jpg656fc22e348b4ca5815e8dde3aba0a55MD53open access1884/412672023-02-23 12:01:29.96open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/41267Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082023-02-23T15:01:29Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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