Expressão e caracterização da lipase LIPC12 e suas variantes : LIPC12G185C-Y244C e LIPC12W184C-Y244C

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Kriczinski, Rafaela
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/89112
Resumo: Orientadora: Prof.ª Dra. Nadia Krieger
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spelling Alnoch, Robson Carlos, 1987-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Krieger, Nadia, 1952-Kriczinski, Rafaela2024-07-31T14:14:59Z2024-07-31T14:14:59Z2022https://hdl.handle.net/1884/89112Orientadora: Prof.ª Dra. Nadia KriegerCoorientador: Prof. Dr. Robson Carlos Alnoch (FFCLRP-USP)Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 30/08/2022Inclui referênciasResumo: Lipases constituem uma família de enzimas amplamente empregada em biocatálise, e podem ser utilizadas em processos industriais devido à sua alta eficiência catalítica. No entanto, para que possam ser aplicadas em larga escala, é necessário que elas sejam estáveis nas condições necessárias para aplicações industriais, que normalmente ocorrem em faixas de temperaturas mais elevadas. Assim, o melhoramento da termoestabilidade de lipases é importante e este pode ser atingido através da inserção de interações moleculares como pontes dissulfeto, por meio da inserção de resíduos de cisteína na estrutura da proteína. A lipase LipC12, obtida por prospecção metagenômica, é uma candidata ideal para o melhoramento da termoestabilidade, uma vez que tem a sua estrutura cristalográfica conhecida e é uma enzima com propriedades mesofílicas. O objetivo deste trabalho foi a expressão e a caracterização de duas novas variantes de LipC12, LipC12W184C-Y244C e LipC12G185C-Y244C, nas quais foram inseridos dois resíduos de cisteína por mutagênese sítio-dirigida. Para a expressão, células de Escherichia coli BL21(DE3) transformadas com o plasmídeo contendo o gene de LipC12 selvagem (LipC12WT) ou das variantes foram expressas e a purificação das enzimas foi feita por cromatografia de afinidade em uma coluna de níquel. As variantes foram caracterizadas com relação à sua atividade hidrólitica por método espectrofotométrico, utilizando ésteres do álcool p-nitrofenol e por método titulométrico, utilizando triglicerídeos de diferentes comprimentos de cadeia. A variante LipC12G185C-Y244C foi também imobilizada em Accurel MP-1000 para avaliar o seu desempenho em meio orgânico, determinando-se a atividade de esterificação a partir da reação de síntese do oleato de etila e de hidrólise da trioleína em n-hexano. A variante LipC12G185C-Y244C apresentou um aumentou significativo (p < 0,05) de atividade para todos os substratos avaliados comparada à atividade de LipC12WT, tanto frente a ésteres de p-nitrofenol quanto frente a triglicerídeos. As maiores atividades foram contra tributirina e estearato de p-nitrofenila (C18:0), com um aumento de 24% e 55%, respectivamente. Por outro lado, a variante LipC12W184C-Y244C apresentou perda de atividade de aproximadamente 80% frente a todos os substratos avaliados. Assim, a variante com maior atividade, LipC12G185C-Y244C, foi utilizada para os ensaios de termoestabilidade a 65 e 70 °C. Observou-se que a nova variante LipC12G185C-Y244C não melhorou significativamente sua termoestabilidade em comparação com LipC12WT e também não houve variação nos perfis de pH e temperatura ótimos na atividade para esta variante. Nos ensaios de imobilização, LipC12G185C-Y244C apresentou 166±5 U g-1 de atividade contra trioleína em meio orgânico e, em reações de esterificação, apresentou uma atividade de 12±1 U g-1. Estes valores representam aproximadamente a metade do valor obtido com LipC12WT, mostrando que a inserção da ponte dissulfeto na estrutura da variante prejudicou sua atuação em meio orgânico após a imobilização. Ensaios futuros deverão ser realizados no sentido de se aprofundar a caracterização das variantes para explicar o comportamento observado neste trabalho. A alta atividade hidrólitica encontrada para a variante LipC12G185C-Y244C sugere o desenvolvimento de aplicações desta enzima que visem reações hidrolíticas de interesse industrial.Abstract: Lipases are a family of enzymes widely used in biocatalysis, and can be used in industrial processes due to their high catalytic efficiency. However, for them to be applied on a large scale, they must be stable under the necessary conditions for industrial applications, which normally occur in higher temperature ranges. Thus, improving the thermostability of lipases is important and this can be reached through the insertion of molecular interactions such as disulfide bonds, through the insertion of cysteine residues in the protein structure. LipC12 lipase, obtained by metagenomic prospecting, is an ideal candidate for improving thermostability, since its crystallographic structure is known and is an enzyme with mesophilic properties. The objective of this work was the expression and characterization of two new variants of LipC12, LipC12W184C-Y244C and LipC12G185C-Y244C, in which two cysteine residues were inserted by site-directed mutagenesis. For expression, Escherichia coli BL21(DE3) cells transformed with the plasmid containing the wild-type LipC12 (LipC12WT) gene or the variants were expressed, and the enzymes purification was performed by affinity chromatography on a nickel column. The variants were characterized by their hydrolytic activity by spectrophotometric method, using p-nitrophenol esters and by titrimetric method, using triglycerides of different chain lengths. The LipC12G185C-Y244C variant was also immobilized in Accurel MP-1000 to evaluate its performance in organic medium, determining the esterification activity from the synthesis reaction of ethyl oleate and the hydrolysis of triolein in n-hexane. The LipC12G185C-Y244C variant showed a significant increase (p < 0.05) of activity for all substrates evaluated compared to the activity of LipC12WT, both against -nitrophenol esters and against triglycerides. The highest activities were against tributyrin and -nitrophenyl stearate (C18:0), with an increase of 24% and 55%, respectively. On the other hand, the variant LipC12W184C-Y244C showed a loss of activity of approximately 80% against all substrates evaluated. Thus, the variant with the highest activity, LipC12G185CY244C, was used for thermostability tests at 65 and 70 °C. It was observed that the new variant LipC12G185C-Y244C did not significantly improve its thermostability compared to LipC12WT and there was also no variation in the optimal pH and temperature profiles in activity for this variant. In the immobilization assays, LipC12G185C-Y244C showed 166±5 U g-1 of activity against triolein in organic medium and, in esterification reactions, it showed an activity of 12±1 U g-1. These values represent approximately half of the value obtained with LipC12WT, showing that the insertion of the disulfide bridge in the structure of the variant impaired its performance in organic media after immobilization. Future tests should be carried out to deepen the characterization of the variants to explain the behavior observed in this work. The high hydrolytic activity found for the LipC12G185C-Y244C variant suggests the development of applications of this enzyme aimed at hydrolytic reactions of industrial interest.1 recurso online : PDF.application/pdfLipaseProteínasMutageneseBioquímicaExpressão e caracterização da lipase LIPC12 e suas variantes : LIPC12G185C-Y244C e LIPC12W184C-Y244Cinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - RAFAELA KRICZINSKI.pdfapplication/pdf20610339https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/89112/1/R%20-%20D%20-%20RAFAELA%20KRICZINSKI.pdfc61bd34b39ef3af6251bd08f34788350MD51open access1884/891122024-07-31 11:14:59.962open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/89112Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-07-31T14:14:59Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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