Estudos de expressão da lipase de metagenômica LipC12 em Pichia pastoris

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Kloster, Fernanda Mayara, 1996-
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/74422
Resumo: Orientador: Prof.ª Dr.ª Nadia Krieger
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spelling Kloster, Fernanda Mayara, 1996-Almeida, Janaína Marques de, 1984-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Krieger, Nadia, 1952-2022-04-05T16:14:11Z2022-04-05T16:14:11Z2021https://hdl.handle.net/1884/74422Orientador: Prof.ª Dr.ª Nadia KriegerCoorientador: Dr.ª Janaina Marques de AlmeidaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências: Bioquímica. Defesa : Curitiba, 01/10/2021Inclui referênciasResumo: O uso da levedura metilotrófica Pichia pastoris como hospedeiro heterólogo apresenta várias vantagens com relação a Escherichia coli, já que esta levedura é capaz de contornar problemas comumente encontrados na expressão de proteínas heterólogas em E. coli, como a falta de modificações pós-traducionais, formação de corpos de inclusão e baixa expressão, no caso de algumas proteínas. Além disso, em P. pastoris há a possibilidade da secreção das proteínas, o que proporciona uma redução do número de etapas do processo de purificação da proteína. Visando aumentar os níveis de expressão e diminuir as etapas de purificação e recuperação da proteína, foram realizados estudos de clonagem e expressão da lipase LipC12, obtida por prospecção metagenômica, em P. pastoris. Na primeira etapa do trabalho, foi feita a clonagem do gene lipC12 no vetor de expressão pGAPZ(alfa) através da clonagem em E. coli, obtendo-se assim o plasmídeo pLipC12N9(alfa). Na segunda etapa, foi realizada a clonagem e expressão deste plasmídeo em P. pastoris, seguidas da seleção de colônias com múltiplas cópias através do cultivo sequencial em concentrações crescentes de zeocina. Em seguida, foi feita a determinação qualitativa da atividade de hidrólise das colônias selecionadas em placas de Petri ágar-tributirina, sendo que o clone com maior halo de hidrólise foi selecionado para expressão de LipC12. Para a expressão em cultivos submersos, foram estudados o tempo de cultivo e a temperatura. Além desses dois parâmetros, foi feita a expressão de LipC12 em meio de cultivo tamponado para evitar valores básicos de pH, que, nos ensaios anteriores de expressão, variaram entre 9,0 e 11,0. A fração extracelular livre de células foi analisada quanto à atividade através da medida do diâmetro do halo de hidrólise em placas ágar-tributirina, sendo que o maior halo de hidrólise, de 2,4 cm, foi obtido em 48 h, a 30 °C. LipC12 presente no extrato extracelular foi então purificada e apresentou 6,1 ± 0,1 U mg-1 de atividade contra palmitato de p-nitrofenila (pNPP). Em todos os ensaios, LipC12 expressa em P. pastoris apresentou baixa atividade quando comparada com LipC12 expressa em E. coli, indicando a necessidade da otimização da expressão da lipase.Abstract: The use of the methylotrophic yeast Pichia pastoris as a heterologous host has several advantages over Escherichia coli, as this yeast can overcome problems commonly found in the expression of heterologous proteins in E. coli, such as the lack of post-translational modifications, formation inclusion bodies and low expression, in the case of some proteins. Furthermore, in P. pastoris expression occurs extracellularly, which provides a reduction in the number of steps in the protein purification process. Aiming to increase expression levels and decrease protein purification and recovery steps, cloning and expression studies of LipC12 lipase, obtained by metagenomic prospecting, were carried out in P. pastoris. In the first stage of the work, the lipC12 gene was cloned into the pGAPZ9(alpha) expression vector through cloning in E. coli, thus obtaining the plasmid pLipC12N(alpha). In the second step, the cloning and expression of this plasmid in P. pastoris was performed, followed by the selection of colonies with multiple copies through sequential cultivation in increasing concentrations of zeocin. Then, the qualitative determination of the hydrolysis activity of the selected colonies was made in tributyrin-agar Petri dishes and the clone with the largest hydrolysis halo was selected for expression of LipC12. For expression in submerged cultures, cultivation time and temperature were studied. In addition to these two parameters, LipC12 was expressed in a buffered culture medium to avoid basic pH values, which, in previous expression assays, ranged between 9.0 and 11.0. The cell-free extracellular fraction was analyzed for activity by measuring the diameter of the hydrolysis halo on tributyrin agar plates, with the largest hydrolysis halo, 2.4 cm, being obtained in 48 h at 30 °C. LipC12 present in the extracellular extract was then purified and showed 6.1 ± 0.1 U mg-1 activity against p-nitrophenyl palmitate (pNPP). In all assays, LipC12 expressed in P. pastoris had a low activity when compared to LipC12 expressed in E. coli, indicating the need for to optimize the expression of the lipase.1 recurso online : PDF.application/pdfLipaseMetagenômicaExpressão gênicaBioquímicaEstudos de expressão da lipase de metagenômica LipC12 em Pichia pastorisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - FERNANDA MAYARA KLOSTER.pdfapplication/pdf4170020https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/74422/1/R%20-%20D%20-%20FERNANDA%20MAYARA%20KLOSTER.pdfc5ca8afada8f05e19374878b13d97394MD51open access1884/744222022-04-05 13:14:11.235open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/74422Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082022-04-05T16:14:11Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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