Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Belisário, Matheus Regis
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/30258
Resumo: Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga
id UFPR_d966268213aa2ea19480d7a8241d6215
oai_identifier_str oai:acervodigital.ufpr.br:1884/30258
network_acronym_str UFPR
network_name_str Repositório Institucional da UFPR
repository_id_str 308
spelling Chaim, Olga Meiri, 1980-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularVeiga, Silvio Sanches, 1962-Belisário, Matheus Regis2023-09-15T16:20:44Z2023-09-15T16:20:44Z2013https://hdl.handle.net/1884/30258Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaCoorientadora : Profª. Drª. Olga Meiri ChaimDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2013Bibliografia: fls 105-118Resumo: A partir do veneno de L. intermedia várias toxinas foram clonadas e vêm sendo caracterizadas bioquímica e biologicamente. Dentre as toxinas clonadas estão as fosfolipases-D que são responsáveis pela maioria dos efeitos biológicos causados pelo veneno, porém, a ação desta e das demais toxinas parece depender de uma ação combinada ou sinérgica que resulta no loxoscelismo. Loxoscelismo é a denominação do quadro clínico provocado em pacientes picados por aranhas do gênero Loxosceles. Até o momento, sete isoformas de fosfolipases-D foram clonadas e parcialmente caracterizadas. Todas essas isoformas recombinantes de fosfolipases-D, com exceção da mais recente, foram expressas na cepa bacteriana E. coli BL21(DE3)pLysS que não possui controle ou auxilio na formação de pontes dissulfeto intracadeia polipeptídica. Utilizando a primeira isoforma obtida (LiRecDT1), foi demonstrado a partir de cristalografia que essa enzima possui quatro cisteínas na sua cadeia polipeptídica que formam duas pontes dissulfeto e que essas pontes têm relação com a atividade das fosfolipases-D e com a sua estrutura terciária. Todas as sete isoformas possuem estas cisteínas conservadas e mesmo havendo também uma relevante conservação aminoacídica no sítio catalítico das isoformas de fosfolipases-D, o restante dos aminoácidos das sequências varia o suficiente para contribuir em mudanças nos níveis de atividade e solubilidade entre elas. Assim, sabendo-se que alterações nas estruturas podem interferir na intensidade das suas atividades, bem como na solubilidade em ambientes biológicos, realizamos a expressão de quatro isoformas (LiRecDT1, LiRecDT2, LiRecDT3 e LiRecDT1 H12A) na cepa até então utilizada e na cepa E. coli SHuffle T7 express LysY, que auxilia na formação de pontes dissulfeto e possui ambiente favorável a proporcionar opções de dobramentos alternativos às proteínas recombinantes. Essas quatro isoformas produzidas em ambas às cepas foram então purificadas e submetidas a ensaios de cunho bioquímico e biológico. Estes ensaios foram realizados com o intuito de serem realizadas comparações para avaliar se haveriam mudanças nos níveis de atividade e/ou solubilidade até então conhecidos para as quatro isoformas escolhidas. Todos os resultados mostraram não haver diferenças estatisticamente significantes nos níveis de atividade para as toxinas testadas, embora expressas em cepas diferentes. Entretanto, algumas características da nova cepa contribuíram para a diminuição do rendimento final de purificação quando comparadas com as purificadas a partir da outra cepa. A predição estrutural acabou revelando novas questões que certamente se tornarão alvos de estudo para melhor compreensão da atividade dessas enzimas. Estre trabalho indicou que embora produzidas nesta nova cepa que possui refinamento para proporcionar um melhor dobramento, estas toxinas já estavam obtendo sua conformação correta espontaneamente quando produzidas na cepa bacteriana E. coli BL21(DE3)pLysS até então utilizada.Abstract: From the venom L. intermedia various toxins were cloned and has been characterized biochemical and biologically. Loxoscelism is the name of the clinical picture provoked in patients bitten by Loxosceles spiders. Among the cloned toxins are the phospholipases-D, that are responsible for most of the biological effects caused by the poison, however, the action of this and other toxins seems to depend on a combined or synergistic action that results in loxocelism. To date seven phospholipase-D isoforms have been cloned and partially characterized. All these recombinant isoforms of phospholipase-D, except the most recent, were expressed in the bacterial strain E. coli BL21(DE3)pLysS that has no control or aid in forming intrachain polypeptide disulfide bonds. Using the first isoform obtained (LiRecDT1) X-ray diffraction crystallography has allowed to demonstrate that this enzyme has four cysteines in its polypeptide chain that form two disulfide bonds, and that these bonds are related to the phospholipase-D activity and its tertiary structure. All of the seven isoforms possess these cysteines conserved and also while there is significant amino acids conservation in the catalytic site of the phospholipases-D isoforms, the remaining amino acid sequence varies enough to contribute to changes in activity levels and solubility among them. So, knowing that changes in the structures can interfere in the intensity of their activities, as well as solubility in biological environments, we performed the expression of four isoforms (LiRecDT1, LiRecDT2, LiRecDT3 LiRecDT1 and H12A) in the strain so far used and in the E. coli SHuffle T7 Expression LysY strain, which aids in the disulfide bonds formation and has favorable environment to provide alternative options to the recombinant protein folding. These four isoforms produced in both strains were then purified and subjected to biological and biochemical tests. These assays were performed with the intention to be performed comparisons to assess whether there would be changes in activity levels and/or solubility so far known for the four isoforms chosen. All results showed no statistically significant differences in activity levels for the tested toxins, although expressed in different strains. However, some features of the new strain contributed to the decrease in the final yield of purification when compared with the proteins purified from the other strain. The structural predctions eventually revealed new questions that surely will become targets of study to better understand the activity of these enzymes. This work indicates that although produced on this new strain that has refinement to provide an improved folding, these toxins were already getting their correct conformation spontaneously when produced in the bacterial strain E. coli BL21(DE3)pLysS so far used.118f. : il. [algumas color.], grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalTesesAranhas - VenenoFosfolipasesCitologia e biologia celularBiologia molecularCaracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysYinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - MATHEUS REGIS BELISARIO.pdfapplication/pdf3346747https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30258/1/R%20-%20D%20-%20MATHEUS%20REGIS%20BELISARIO.pdf05a06bcf31c9315859294f1e14efbbeaMD51open accessTEXTR - D - MATHEUS REGIS BELISARIO.pdf.txtExtracted Texttext/plain190634https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30258/2/R%20-%20D%20-%20MATHEUS%20REGIS%20BELISARIO.pdf.txt7b36e96704d955d637e87b3c7dd8deadMD52open accessTHUMBNAILR - D - MATHEUS REGIS BELISARIO.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1314https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30258/3/R%20-%20D%20-%20MATHEUS%20REGIS%20BELISARIO.pdf.jpg6daeda112390d30ae2907294478e2723MD53open access1884/302582023-09-15 13:20:44.413open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/30258Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082023-09-15T16:20:44Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
dc.title.pt_BR.fl_str_mv Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY
title Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY
spellingShingle Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY
Belisário, Matheus Regis
Teses
Aranhas - Veneno
Fosfolipases
Citologia e biologia celular
Biologia molecular
title_short Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY
title_full Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY
title_fullStr Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY
title_full_unstemmed Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY
title_sort Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY
author Belisário, Matheus Regis
author_facet Belisário, Matheus Regis
author_role author
dc.contributor.other.pt_BR.fl_str_mv Chaim, Olga Meiri, 1980-
Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
dc.contributor.advisor1.fl_str_mv Veiga, Silvio Sanches, 1962-
dc.contributor.author.fl_str_mv Belisário, Matheus Regis
contributor_str_mv Veiga, Silvio Sanches, 1962-
dc.subject.por.fl_str_mv Teses
Aranhas - Veneno
Fosfolipases
Citologia e biologia celular
Biologia molecular
topic Teses
Aranhas - Veneno
Fosfolipases
Citologia e biologia celular
Biologia molecular
description Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga
publishDate 2013
dc.date.issued.fl_str_mv 2013
dc.date.accessioned.fl_str_mv 2023-09-15T16:20:44Z
dc.date.available.fl_str_mv 2023-09-15T16:20:44Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/1884/30258
url https://hdl.handle.net/1884/30258
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.pt_BR.fl_str_mv Disponível em formato digital
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv 118f. : il. [algumas color.], grafs., tabs.
application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Institucional da UFPR
instname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)
instacron:UFPR
instname_str Universidade Federal do Paraná (UFPR)
instacron_str UFPR
institution UFPR
reponame_str Repositório Institucional da UFPR
collection Repositório Institucional da UFPR
bitstream.url.fl_str_mv https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30258/1/R%20-%20D%20-%20MATHEUS%20REGIS%20BELISARIO.pdf
https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30258/2/R%20-%20D%20-%20MATHEUS%20REGIS%20BELISARIO.pdf.txt
https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30258/3/R%20-%20D%20-%20MATHEUS%20REGIS%20BELISARIO.pdf.jpg
bitstream.checksum.fl_str_mv 05a06bcf31c9315859294f1e14efbbea
7b36e96704d955d637e87b3c7dd8dead
6daeda112390d30ae2907294478e2723
bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv MD5
MD5
MD5
repository.name.fl_str_mv Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1813898746916765696

Registros relacionados